باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا C. ايليجانس

يوضح هذا الفيديو إجراء لتحديد الجينات التي تنظم ، انظر نمو elgan وحجم الجسم. باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي أو عين الحمض النووي الريبي لتعطيل الجينات المرشحة ، يتم تحضير الصفائح الأولى التي تحتوي على بكتيريا عبرت عن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، والتي تستهدف الجينات ذات الأهمية. يتم نقل الخنثى في مرحلة اليرقات الرابعة إلى ألواح RNAi.

بمجرد وصولهم إلى مرحلة الشباب ، يتم نقلهم إلى ألواح RNAI جديدة لوضع البيض. بعد عدة ساعات ، تتم إزالتها تاركة مجموعات متزامنة من الأجنة. في المرحلة المرغوبة من التطوير ، تم جمع النسل وتركيبه على الشرائح.

أخيرا ، يتم الحصول على صور مجهرية للديدان. يوضح تحليل الصورة التغيرات في حجم الجسم الناتجة عن تعطيل الجينات. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد منظمات مسار إشارات TGF beta ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على المسارات الأخرى التي تنظم تطور ما بعد الجنين في أناقة البحر ، مثل مسار إشارات الأنسولين.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق استنساخ التسلسلات الجينية المستهدفة في ناقل L 4 4 4 0 بلازميد RNAi الدودي شائع الاستخدام يحول البلازميد المؤتلف إلى سلالة بكتيرية. HT واحد 15 DE ثلاثة ثقافة. البكتيريا المحولة على ألواح أجار LB مع 25 ميكروغرام لكل مليلتر من الكربونيك و 12.5 ميكروغرام لكل مليلتر التتراسيكلين ، ثم اختيار استنساخ واحد للاستخدام في المستقبل.

في هذه الأثناء، حول المتجه الفارغ L 4 4 4 0 إلى السلالة البكتيرية. HT واحد 15. لاستخدامها كعنصر تحكم في ثقافة التجارب ، البكتيريا المحولة في مليلتر واحد من مرق LB مع 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

لا يضاف التتراسيكلين لأنه يقلل من كفاءة RNAI. أضف خمسة ملليلتر أخرى من مرق LB مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين إلى الثقافة الليلية ثم احتضن لمدة أربع إلى ست ساعات أخرى عند 37 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح الثقافة جاهزة ، قم بزرع 0.5 مل من البكتيريا التجريبية أو الضابطة على ألواح دودة RNAI المسمى باسم الاستنساخ المناسب.

يجب تحضير طبقين على الأقل لكل حالة. احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي.

يجب أن يكون هناك عشب من البكتيريا يعبر عن الحمض النووي الريبي مع أو بدون تسلسل الجينات المستهدف. ستستخدم البكتيريا كمصدر للغذاء. بمجرد أن تصبح ألواح تغذية RNAI جاهزة ، تقوم النيران بتعقيم طرف السلك البلاتيني.

ثم استخدم السلك البلاتيني لنقل ستة إلى عشرة مراحل اليرقات الرابعة أو L four C elgan خنثى إلى كل صفيحة RNAi. دع الخنثى تنمو عند 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، ستكون من الشباب البالغين.

انقلها إلى لوحة RNAI جديدة مصنفة ومعدة بشكل مناسب. احتضن الصفائح عند 20 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات للسماح للبالغين بوضع البيض. بعد الحضانة ، قم بإزالة جميع البالغين من اللوحة لمزامنة النسل.

بمجرد إزالة البالغين ، ابدأ في حساب الوقت. هذا هو الوقت صفر. احتضان الصفائح عند 20 درجة مئوية للسماح للحيوانات بالنمو إلى مرحلة النمو ذات الاهتمام.

هنا ، سيتم اختيار الشباب لتحليل النمط الظاهري. بالنسبة للضربات القاضية التي تتطور بمعدل طبيعي ، يلزم حضانة لمدة 72 ساعة. ضع في اعتبارك أن الجينات المختلفة تؤثر على نمو بشكل مختلف ، لذلك قد تحتاج أوقات الحضانة إلى التعديل.

إذا تسبب الحمض النووي الريبي في نمو بمعدل مختلف ، فيمكن تحديد الشباب على أنهم أولئك الذين لم يمضوا أكثر من 24 ساعة على L أربعة مع اكتمال نمو VUL واثنين إلى ستة أجنة في الرحم كما هو موضح هنا. لتحديد مراحل النمو الأخرى ، يجب على المحقق استخدام تطور الغدد التناسلية و VUL كدليل. بمجرد أن تنمو إلى المرحلة المناسبة ، استعد لتسجيل الأنماط الظاهرية لحجم الجسم للديدان المعالجة بالحمض النووي الريبي.

بعد ذلك ، ضع طبقتين من شريط الملصقات الملون على زجاج ، شريحة عينة بسمك ملليمتر واحد كما هو موضح هنا. اصنع اثنتين من هذه الشرائح الزجاجية. ثم ضع شريحة زجاجية جديدة بين الشريحتين بالشريط وقم بتطبيق قطرة 2٪ Agros المذاب في الماء.

إلى منتصف الشريحة الزجاجية الجديدة ، اضغط على شريحة زجاجية ثانية في الأعلى لعمل وسادة رقيقة من agros. بمجرد أن تصلب agros ، قم بإزالة الزجاج العلوي. حرك الشريحة مع وسادة agros جاهزة لتحميل الديدان.

قم بتسمية الشريحة باسم الاستنساخ. أضف 10 ميكرولترات من أزيد الصوديوم 25 مللي مولار إلى وسادة aros. ثم باستخدام سلك بلاتيني كما كان من قبل ، انقل 30 إلى 40 إلى محلول أزي الصوديوم.

لشل حركتهم ، ضع زلة غطاء في الأعلى. افعل ذلك لكل من المؤتلف والفارغ L 4 4 4 0 التي تحمل المعالجة بالحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، ضع شريحة الميكرومتر تحت مجهر التشريح بعدسة موضوعية 2.5 ×.

باستخدام Q Capture أو برامج مشابهة ، التقط صورة لمسطرة الميكرومتر واحفظها. ثم ضع الديدان تحت المنظار والتقط الصور. لقياس طول الجسم أولا ، افتح صورة مسطرة الميكرومتر في برنامج Image Pro.

ثم انقر فوق قياس واختر المعايرة. ثم اختر معالج المعايرة المكانية مع معايرة الصورة النشطة المحددة. انقر فوق التالي.

أدخل اسم المعايرة وتأكد من ضبط الوحدات المرجعية المكانية على ميكرون. ثم تحقق من الزر إنشاء معايرة مرجعية وانقر فوق التالي. انقر فوق رسم الخط المرجعي.

سيظهر شريط مقياس مرجعي. أعد وضع شريط المقياس ليتناسب مع طرفي الميكرومتر. ثم أشر إلى أن المرجع يشير إلى 1000 وحدة.

انقر فوق موافق. التالي والانتهاء. بمجرد معايرة البرنامج ، افتح صورة دودة.

ثم ضمن قائمة القياس ، حدد المعايرة ، ثم انقر فوق تحديد مكاني. في القائمة المنسدلة، حدد اسم الملف الذي تم إنشاؤه لمعايرة الميكرومتر. ثم ضمن قائمة القياس ، حدد القياسات في النافذة التي تفتح.

حدد أداة الرسم الحرة وباستخدام ماوس الكمبيوتر ، قم بتتبع خط عبر مركز جسم من الرأس إلى الذيل. سيتم الإبلاغ عن الطول في النافذة. كرر هذه العملية لجميع في الحقل.

تصدير قياسات الطول إلى ملف Microsoft Excel أو أي برنامج إحصائي آخر مناسب. تحليل البيانات عن طريق حساب المتوسط والانحراف المعياري لكل عينة. ثم قارن النتائج لكل مجموعة باستخدام اختبار T الخاص بالطالب.

مطلوب عامل النمو المحول بيتا أو بروتين TGF beta SUPERFAMILY DBL واحد لتنشيط مسار TGF beta. استجابة لتنشيط الإشارة ، تقوم محولات إشارة smad داخل الخلايا بالانتقال إلى النواة وبدء نسخ الجينات. شاهد الأناقة التي يتعطل فيها مسار TGF beta بحجم جسم أصغر ، بما في ذلك طول جسم أقصر من البرية.

وبالتالي شاشات لأناقة البحر. طفرات حجم الجسم قادرة على تحديد مكونات ومعدلات إشارات TGF beta لاختبار فعالية RNAi عن طريق التغذية لتحديد طفرات حجم الجسم. تم استخدام RNAi لإسقاط مكونات مسار DBL واحد SMA ثلاثة في SMA ستة في أربع سلالات مختلفة من أناقة البحر.

تضمنت سلالات الأناقة C التي تم اختبارها سلالة RN الذكاء الاصطناعي شديدة الحساسية A واحد ، Lin 15 B ، و RF ثلاثة ، بالإضافة إلى سلالة النوع البري القياسية N two وسلالة LIN 36 ، التي تشبه حساسية RNAi N اثنين كما هو موضح هنا. عندما تعطل تعبير SMA three أو SMA six ، أظهرت حجم جسم أقصر بكثير من التحكم باستثناء SMA six RNAi في Lin 36. الخلفية في RF ثلاثة.

أطوال الجسم الأساسية للشباب بعد العلاج بالحمض النووي الريبي 84 إلى 95٪ من الناقل وحده. في A واحد لين 15 ب أطوال الجسم الخلفية للشباب البالغين بعد الحمض النووي الريبي كانت 68 إلى 86٪ من الضابطة. ومع ذلك ، فإن سلالة A one lin 15 B تنتج ذرية الرؤية.

هذا يجعلها غير مناسبة للفحص على نطاق واسع. لذلك ، يقترح استخدام سلالة RF الثلاث لهذه التقنيات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الجينات التي تنظم النمو وحجم الجسم باستخدام تقنية تداخل RNI.