التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور المستقبلات العصبية أثناء إدراجها في الغشاء البلازمي في عصبونات الفئران الأولية المستزرعة. ولتحقيق ذلك، يتم الحصول على الخلايا الدبقية (GL) للفئران من القشرة المخية للفئران الجنينية أو حديثة الولادة، وتُزرع على أدراج استنبات مطلية بالكولاجين وشبه نفاذة. يتم تعليق المزارع الدبقية فوق عصبونات الحصين الجنينية الأولية على شرائح غطاء.

بعد ذلك، وعقب سبعة أيام من التهيئة، يتم نقل جين مستقبل الدوبامين D2 المسمى بفلورين فائقة الكسوف (super ecliptic fluorine) إلى الخلايا العصبية. يتمركز المستقبل المسمى في الحويصلات داخل الخلوية، ولكنه يظل غير فلوري داخل البيئة الحمضية لهذه الحويصلات. ومع ذلك، عندما تندمج الحويصلة مع الغشاء البلازمي، يتعرض الفلورين لدرجة الـ pH المتعادلة للبيئة خارج الخلوية، فيتوهج بوضوح مما يتيح اكتشافه بواسطة مجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال نقل بروتينات الغشاء، مما يمكننا من تصور نقل أي بروتينات غشائية يمكن وسمها بالفلور، مثل مستقبلات الغلوتامات والمستقبلات المقترنة بالبروتين ج. وسيقوم بتوضيح الإجراء معي اليوم كل من بريدينج دراي، وعضوين آخرين من مجموعتنا البحثية. قبل يوم من إجراء التشريح، يتم تجهيز دوارق T 75 بمحلول الكولاجين، وتوضع الدوارق في وضع عمودي وتترك لتجف طوال الليل. وفي يوم استزراع الخلايا الدبقية، يتم تدفئة الوسط الدبقي لمدة 30 دقيقة على الأقل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C، وبعد القتل الرحيم، يتم تشريح القشور المخية للفئران الجنينية أو حديثة الولادة تحت مجهر التشريح.

ضع القشور التي تمت إزالتها في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter مملوء بسائل دماغي شوكي اصطناعي بارد ومثلج، أو A CSF. بعد ذلك، قم بإزالة كل كمية من A CSF باستثناء 2 milliliters، ثم أضف 100 microliters من محلول pepane و 20 microliters من 1%DNAs.One. ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 degrees Celsius واترك الأنسجة لتهضم لمدة 20 minutes.

بعد عملية الهضم، اغسل أنسجة الدماغ بعناية عن طريق إزالة محلول البروبان بحذر وإضافة 10 milliliters من الوسط الدبقي المسخن مسبقاً. ثم، مع الحرص على عدم تعريض النسيج للاضطراب، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط الدبقي.

أضف 2 mL من وسط الخلايا الدبقية الطازج، وباستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار، قم بالترشيح حتى لا تعود الأنسجة مرئية. تجنب تكوين فقاعات بمجرد تفكك الأنسجة تماماً. أضف 8 mL إضافية من وسط الخلايا الدبقية الطازج وقم بنقل المعلق بواسطة الماصة عبر مصفاة خلايا بقطر مسامي 70 micron.

جمّع السائل المار في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. انقُل الخلايا المفككة من جنينين إلى ثلاثة أجنة إلى دورق T 75 مطلي بالكولاجين، وازرعها عند 37 degrees Celsius في حاضنة زراعة الأنسجة طوال الليل. وفي اليوم التالي، اشفط الوسط الزراعي، ثم اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 milliliters من PBS.

بعد ذلك، أضف من 10 إلى 15 milliliters من وسط نمو الخلايا الدبقية الطازج إلى كل قارورة. قم بتحضين المزارع لمدة تتراوح من 10 إلى 12 يوماً، مع تغيير الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. وبمجرد وصول الخلايا إلى حالة الالتحام، اشطف الخلايا الدبقية باستخدام PBS.

ثم أضف 5 mm من trypsin بتركيز 0.05% إلى القارورة واترك الخلايا لتنفصل لمدة خمس دقائق عند 37 °C. بعد هذه الحضنة القصيرة، أضف الوسط الدبقي واستخدم الماصة لفصل GL من قاع القارورة. قم بتوزيع الخلايا على قارورتين T 75 جديدتين مطلية بالكولاجين.

بمجرد وصول الخلايا إلى مرحلة الالتحام، يتم إجراء عملية التريبتة (trypsinize) كما سبق، ثم يتم استزراع محتويات كل دورق في أطباق ذات ستة آبار تحتوي على حشوات زراعية مغطاة بالكولاجين. توضع هذه الحشوات فوق 2 mL من وسط زراعة الخلايا الدبقية، وتترك الخلايا لمدة تتراوح من يوم واحد إلى سبعة أيام. ستُستخدم حشوات الزراعة الدبقية هذه لتهيئة المزارع العصبونية.

أضف أربعة ملليلترات من وسط الزراعة إلى كل بئر من آبار لوحة زراعة سداسية تحتوي على شرائح غطاء مغطاة بالبولي ليسين المنظفة، ثم ضع اللوحة في حاضنة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius طوال الليل. تزيد هذه الخطوة من احتمالية بقاء الخلايا العصبية على قيد الحياة، وذلك على الأرجح عن طريق إزالة بقايا البولي ليسين في اليوم التالي. قم بإزالة وسط الزراعة واستبدله بملليلترين من وسط زراعة جديد.

وسط يحتوي على 2% من الوسط. مكمل B 27 لاستزراع العصبونات الحصينية. تحت مجهر تشريحي، يتم تشريح الحصين من الأنسجة الدماغية لأربعة أجنة فئران في الأيام الجنينية E 15 إلى 18. توضع الحصينات في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter يحتوي على محلول تشريح منظم مبرد بالثلج.

بعد ذلك، قم بتشريح الجسم المخطط من أنسجة دماغ ثلاثة أجنة فئران في المرحلة العمرية E 15 إلى 18، وضعها في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 milliliter يحتوي على محلول منظم للتشريح مبرد بالثلج. قم بهضم الأنسجة باستخدام pepane كما سبق. ثم استخدم مقياس خلايا الدم.

قم بتحديد عدد الخلايا في كل معلق عصبي ثم ازرعها. ضع في كل شريحة غطاء 0.4 × 10⁶ من الخلايا وازرعها في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل. ولتحضير غرسات المزارع الدبقية لتهيئة المزارع العصبية، قم بشفط الوسط من غرسات المزارع الدبقية والأطباق، واستبدله بمقدار 2 mL من وسط الزرع الطازج في كل منها.

في اليوم التالي، ضع شرائح الغطاء التي تحتوي على العصبونات في كل بئر من آبار الطبق أسفل إدراجات زراعة الخلايا الدبقية. استمر في التحضين عند 37 درجة مئوية، وقم باستبدال نصف الوسط بوسط تغذية طازج ومسخن مسبقاً يحتوي على B 27 كل ثلاثة إلى أربعة أيام، وذلك حتى تصبح الخلايا جاهزة لعمليات عفن الجينات وتجارب التصوير.

سيتم إجراء عملية عفن (transfection) للخلايا العصبية في اليوم السابع، وتصويرها في اليوم الثامن من الزراعة. يُعد الاتساق في زراعة الخلايا العصبية الركيزة الأساسية لنجاح تجارب التصوير الحي. يوضح هذا الشكل خلايا عصبية من حصين الفأر تم زراعتها باستخدام هذا البروتوكول من اليوم 11 in vitro إلى اليوم 18 in vitro.

يتضح من الصور أن العصبونات قد طورت استطالات واسعة، وأن الزوائد الشجيرية مغطاة بكثافة بالأشواك الشجيرية. وتعد هذه مؤشرات على أن هذه العصبونات سليمة في المزرعة لكل مزرعة عصبونية. جُمِع 2 µL من lipectomy مع 2001 µg من DNA المشفر لمستقبل الدوبامين D2 المسمى بـ super ecliptic Florin.

امزج الخليط واتركه للحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وأثناء فترة الحضن، اسحب وانقل 1 mL من الوسط من أسفل كل من غرسات مستنبت الخلايا الدبقية و 1 mL من داخلها إلى نفس الأنبوب المخروطي. بعد ذلك، أضف نفس الحجم من وسط التغذية الذي يحتوي على B 27 إلى الوسط الذي تم حفظه، ثم احضنه عند درجة حرارة 37 °C.

سيُستخدم هذا الوسط للاستزراع العصبي بعد عملية عفن الخلية (transfection)، وذلك عقب فترة تحضين خليط الـ DNA مع الليبوزومات لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة مدرجات استزراع الخلايا الدبقية من أطباق الستة آبار. أضف 200 µL من خليط الـ DNA والليبوزومات إلى كل شريحة غطاء تحتوي على عصبونات.

تجنب تكوين فقاعات تحت غشاء المزرعة. استبدل حشوات المزرعة الدبقية واحضنها عند 37 درجة Celsius لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الاحتضان، قم بإزالة الحشوات الدبقية مرة أخرى وشفط محلول عفن التحول من كل بئر، ثم أضف 2 mL من الوسط الذي تم حفظه مسبقاً للخلايا العصبية وأعد وضع حشوات المزرعة الدبقية.

أخيرًا، قم بإزالة الوسط الدبقي من كل قطعة إدخال وأضف 2 mL من الوسط المحفوظ إلى كل مستنبت. اترك الخلايا لمدة تتراوح من 24 إلى 72 ساعة إضافية للسماح بالتعبير عن الـ CD NA المنقول. نظام تصوير TIRF المستخدم في هذا الفيديو هو إعداد مخصص يحتوي على ليزر سيان بقدرة 100 mW للإثارة وكاميرا ذات جهاز اقتران شحني مضاعف للإلكترونات ككاشف. قبل 30 دقيقة من بدء التصوير، قم بتدفئة A CSF إلى 37 °C في حمام مائي. كما يجب تشغيل الليزر والكاميرا وقطعة الإدخال الحرارية، ثم وضع قطعة الإدخال الحرارية على منصة المجهر.

ضع شريحة غطاء تحتوي على عصبونات محولة في غرفة تصوير حي، وأضف بسرعة سائل A CSF المُدفأ مسبقاً. ضع الغرفة على قطعة التسخين الموجودة على منصة المجهر تحت وضع التصوير الفلوري الشامل (epi fluorescent)، وحدد العصبونات المحولة. ثم تحت وضع تصوير TIRF، قم بتبييض العصبونات ضوئياً لمدة دقيقة واحدة للقضاء على أي فلورة فلورية موجودة مسبقاً على الغشاء البلازمي.

بعد ذلك، اضبط إعداد الكسب (gain) لمضاعف الإلكترونات في كاميرا E-M-C-C-D على الحد الأقصى، وابدأ في التقاط الصور لمدة دقيقة واحدة بتردد 10 hertz. سيحتوي كل تسجيل على 600 صورة بمجرد اكتمال عملية التصوير. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج Image J لتحديد إدراج مستقبل الدوبامين D2 في الغشاء.

تم ترنسفكشن عصبون شوكي متوسط من المخطط في فأر ببروتين super ecliptic. Florin المرتبط بمستقبل الدوبامين D2 (PDR D2). بعد ذلك، تم إجراء تصوير TIRF حي، حيث تم التقاط 600 صورة بمعدل صورة واحدة كل 100 milliseconds. تظهر هذه الصورة إسقاط الكثافة القصوى للتسجيل المعتمد على الوقت، وتشير رؤوس السهام البيضاء إلى المواضع التي اندمجت فيها الحويصلات الفردية التي تحتوي على pH DD two مع الغشاء البلازمي.

توضح هذه الصورة إسقاط الكثافة القصوى YT الذي يتم فيه تدوير مكدس XYT بمقدار 90 درجة حول المحور Y، ويُسقط الحد الأقصى للبكسل على كل خط من خطوط المحور X على بكسل واحد للمحور y. ولتقديم معلومات حول الجدول الزمني للإدخال، تُظهر هذه البيانات أنه يمكن استخدام هذه الطريقة بنجاح لفحص تنظيم إدخال المستقبلات في الغشاء البلازمي في الخلايا العصبية للفئران المستزرعة بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال نقل المستقبلات العصبونية لاستكشاف آليات تنظيم مستقبلات الغشاء البلازمي العصبونية الأخرى، والقنوات، والناقلات.