السريرية تطبيق

يعدل هذا البروتوكول الخلايا التائية وراثيا لإدخال مستقبلات مستضد خيمرية خاصة بمستضدات الورم ، ثم ينشر أعدادا مهمة سريريا على الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي المصمم. ابدأ بالنقل الكهربائي للجمال النائم. قم بنقل بلازميدات الحمض النووي A ونقلها إلى خلايا أحادية النواة هادئة معزولة من دم الحبل السري المحيطي أو السري.

ثم قم بقياس كفاءة التعدي باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد الزراعة المشتركة ، الخلايا التائية المنقولة على مدار سبعة أيام على K 5 62 مشتقة من المستضد الاصطناعي مع إضافة السيتوكينات الخارجية في أربعة أسابيع من التحفيز. تستمر دورات الانتشار في تحليل الحفظ بالتبريد وإطلاق الخلايا التائية الإيجابية للسيارة المثقبة بالكهرباء والانتشار للتطبيق البشري.

يوفر نظام نقل الجمال النائم بديلا لأساليب نقل الجينات القائمة على الفيروس لإدخال الجين بثبات في الخلية المختارة. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لنظام الجمال النائم في أنه يمكن للمرء أن يدمج الجينات بتكلفة منخفضة مقارنة ببلازميدات الحمض النووي التي تتكامل من خلال إعادة التركيب غير الشرعي غير المتماثل. وبالتالي ، فإن الميزة هي أنه يمكن استخدام نظام الجمال النائم للتعبير عن الجين بتكلفة منخفضة وكفاءة عالية.

بشكل عام ، سيتعين على الأفراد الجدد في هذه الطريقة في البداية التغلب على كفاءة الخلايا التائية الكهربائية في الانتشار الانتقائي للخلايا التائية الإيجابية للسيارة على الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي. كلتا الخطوتين يصعب إتقانها بسبب الحاجة إلى الثقافة المشتركة. الخلايا التائية المعدلة وراثيا على الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي.

هذه الطريقة مفيدة في مجال العلاج المناعي بالتبني ، لا سيما في توصيل الجينات الفعال والشركة المصنعة لعدد كبير سريريا من الخلايا التائية. يمتد التطبيق الأوسع نحو علاج السرطان لأنه يمكن تعديل الخلايا التائية من الجهاز المناعي لتكون خاصة بالورم. سيظهر الإجراء مارغريت داوسون وماثيو فيولا.

يقوم الفنيون من مختبري أولا بتخفيف الدم المحيطي بحجم متساو من P-B-S-E-D-T-A ودم الحبل السري بأربعة أحجام من P-B-S-E-D-T-A ببطء 25 مل من الدم المخفف على 12 مل من الفيال في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. جهاز الطرد المركزي التدرج الورقي عند 400 Gs لمدة 30 إلى 40 دقيقة دون انقطاع. الآن انقل جزء الخلية أحادية النواة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مليلتر باستخدام P-B-S-E-D-T-A.

ارفع الحجم إلى 50 مل وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. اغسل الخلايا برفق مرة واحدة في 50 مل من الثقافة الكاملة والوسائط وأجهزة الطرد المركزي عند 400 جم لمدة 10 دقائق. ثم قم بتجميع كريات الخلية في CCM لإجراء تعداد الخلايا.

باستخدام طريقة استبعاد triam blue. يمكن الآن استخدام الخلايا أحادية النواة للتثقيب الكهربائي أو حفظها بالتبريد للاستخدام في المستقبل. في حالة استخدام MNC المحفوظ بالتبريد ، قم بإذابة الجليد بسرعة مرتين 10 إلى الخلايا الثامنة للحصول على تثقيب كهربائي واسع النطاق ، انقل الخلايا برفق إلى أنبوب طرد مركزي بحجم مناسب يحتوي على الدفء.

وسائط ثقافة RPMI كاملة خالية من الفينول وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليق الخلايا أحادية النواة في P-F-R-P-M-I قم بإجراء تعداد الخلايا ونقل الخلايا إلى وعاء ثقافة خلية بحجم مناسب بتركيز 10 من الخلايا الست لكل مليلتر. موازنة الخلايا في حاضنة رطبة لمدة ساعتين. حصاد MNC عن طريق الطرد المركزي ، ثم قم بإعادة تعليق كريات الخلية بلطف ودمجها في P-F-R-P-M-I وتعداد الخلايا الآن انقل مرتين 10 إلى MNC الثامن إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 200 Gs لمدة 10 دقائق دون انقطاع.

استنشق المادة الطافية بحيث لا تبقى وسائط متبقية حول حبيبات الخلية. قم بإعداد صفيحة معقمة من 12 بئرا تحتوي على 10 آبار تحتوي على أربعة ملليلتر من P-F-R-P-M-I الدافئ وقم بموازنة اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم أعد تكوين محلول مستجيب Lonzo Nucleo من مجموعة الخلايا التائية البشرية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لكل تفاعل.

يقوم Q Vet بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الرئيسي الذي يحتوي على محلول مستجيب نووي NU مكمل. 15 ميكروغراما من التبديل على البلازميد وخمسة ميكروغرامات من البلازميد المتغير. بعد ذلك ، قم بتفريق حبيبات الخلايا التائية وأعد تعليق مزيج الحمض النووي الرئيسي لمحلول المودة النووي NU عند تركيز خلية نهائي مرتين في 10 من الخلايا السابعة لكل 100 ميكرولتر.

انقل بعناية 100 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل من 10 كوفيت من نواة لونزا مع الحرص على تجنب الفقاعات. الآن اضغط على qve مرة واحدة والكهربائية باستخدام البرنامج U 0 1 4 للخلايا التائية غير المحفزة. انقل الكوفيتات ولوحة البئر المتوازنة 12 إلى غطاء المزرعة باستخدام أموكس من ماصة نقل الطرف الناعم عند 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ من البئر المقابل لكل بئر.

انقل الخلايا المكهربة إلى اللوحة واسمح للخلايا بالتعافي في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعتين. ثم انقل الخلايا من جميع الآبار إلى أنبوب طرد مركزي معقم وحبيبات الخلايا بعد غسل واحد ، وقم بتفريق حبيبات الخلية برفق وتعليق الإعادة في CCM لتحقيق تعليق خلية واحدة. بعد إجراء تعداد الخلايا ، اضبط تركيز الخلية ليميل إلى الخلايا الست لكل مليلتر في CCM.

ثم انقل معلق الخلية إلى قارورة مزرعة وضعها في الحاضنة طوال الليل لتوليد خلايا منقولة EGFP. كرر بروتوكول التثقيب الكهربائي باستخدام خمسة أضعاف 10 من الخلايا الست لكل vete مع خمسة ميكروغرامات من بلازميد EGFP للتحكم في الأموكس. احصد الخلايا المثقبة بالكهرباء ، ثم قم بإجراء عد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد ثلاثية الأزرق.

ثم قم بتلطيخ واحد إلى ضعفين في 10 من الخلايا الست بجسم مضاد خاص بالقرص المضغوط الثالث ، والقرص المضغوط الرابع ، والقرص المضغوط الثامن ، وجاما IgG FC البشري كقياس لتعبير السيارة. الحصول على الخلايا على عيار الفاكس. تحليل البيانات باستخدام برنامج FCS Express لتحديد التعبير عن السيارة.

ثم احسب الخلايا الموجبة للسيارة في الثقافة. استنساخ A PC الرقم أربعة سوف يشتق من K 5 62 خلية للتعبير المشترك عن جزيئات التحفيز المشترك للخلايا التائية المرغوبة ، وقم بإذابة جزء من الإشعاع المجمد ، A A PC في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم اغسل الخلايا و CCM ، قم بتعداد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الرحلة الزرقاء وحساب عدد أجهزة الكمبيوتر القابلة للحياة المطلوبة للتحفيز.

امزج الخلايا الكهربائية التي تعبر عن السيارة وجاما المشعة A A PC في حاوية معقمة بنسبة واحد إلى اثنين. اضبط نسبة A PC للتعبير عن السيارة بناء على قياس التدفق الخلوي في اليوم التالي للتثقيب الكهربائي أضف 30 نانوغراما لكل مليلتر من IL 21 إلى تعليق الخلية. ثم اعتنت Eloqua بالخلايا الست لكل مليلتر في قوارير T 75 أو عرض أكياس ثقافة الحياة والعودة إلى حاضنة الثقافة ، والنقل الكهربائي لبلازميدات الحمض النووي وانتشار الخلايا التائية على جاما المشععة.

يمكن استخدام جهاز الكمبيوتر A لتوليد أعداد جذابة سريريا من الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي ودم الحبل السري للتطبيقات البشرية. في هذا التوصيف للخلايا التائية المعدلة وراثيا من التعبير عن الدم المحيطي ل EGFP في اليوم صفر من دورة التحفيز الأولى ، يتم تقييم الضوابط لكفاءة نقل الجينات للسيارة المحددة CD 19 عن طريق قياس التدفق الخلوي على CD ثلاثة إيجابي ، CD ثمانية إيجابي و CD أربع خلايا تائية موجبة في حوالي 24 ساعة بعد التثقيب الكهربائي. ثم بعد 28 يوما من الزراعة المشتركة على حركية جهاز كمبيوتر A للتعبير عن السيارة على الخلايا التائية التي نمت في نظام مغلق وظيفيا.

يمكن أن يؤدي انتشار الخلايا التائية الإيجابية للسيارة المشتقة من الدم المحيطي بمرور الوقت إلى توليد أعداد جذابة سريريا من الخلايا التائية التي تعبر بثبات عن السيارة. بعد أربعة أسابيع من الزراعة المشتركة على جهاز كمبيوتر ، يبلغ متوسط توسع الطية لثلاث خلايا تائية موجبة للقرص المضغوط حوالي 19،800 مع تعبير سيارة بنسبة 90٪. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار موكب ونشر الخلايا التائية التي تعبر عن السيارة المرغوبة.

تذكر أن تراقب فرط نمو الخلايا القاتلة الطبيعية. عادة ما يتم تحقيق التثقيب الكهربائي وانتشار الخلايا التائية على مدار أربع دورات تحفيز مدتها سبعة أيام. يمكن إجراء مزيد من التحقيقات مثل إطلاق السيتوكين ومقايسات السمية الخلوية لتقييم الخصوصية المعاد توجيهها للخلايا التائية المعدلة وراثيا في مجال العلاج المناعي بالتبني.

تساعدنا هذه التقنية على فهم الإمكانات العلاجية للخلايا التائية التي يتم حقنها في البشر.