Name: وسرطان المثانة نموذج مثلي للدراسات توصيل الجينات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: اكتشف طريقة زراعة خلايا سرطان المثانة MB49 في فئران باستخدام القسطرة لاختبار العلاجات الجينية. يُقاس التعبير الجيني الفيروسي باستخدام تقنية اللوسيفيراز بعد 24 ساعة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R21 CA143505 إلى كريستينا فولكل جونسون.

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة ساوث كارولينا الطبية. تمت الموافقة على البروتوكول تحت الفئة D من وزارة الزراعة الأمريكية للألم. 
1. زرع الخلايا
<ol>
	<li>قبل يومين من تنفيذ الإجراء ، قم بوضع 1 × 106 خلايا ميجابايت 49 في قوارير T-25. استخدم DMEM عالي الجلوكوز المكمل بنسبة 10٪ FBS (والمضادات الحيوية ، إذا رغبت في ذلك). قارورة واحدة تكفي لكل مجموعة تصل إلى خمسة فئران سيتم تخديرها وزرعها بالتوازي.</li>
	<li>في يوم الإجراء ، قم بإعداد التربسين للتقطير عن طريق تخفيف التربسين المعقم بنسبة 0.25٪ من درجة زراعة الأنسجة إلى 0.125٪ مع وسط قاعدة DMEM معقم (تخفيف 1: 2). 1.2 مل يكفي ل 10 فئران. ضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية للتوازن.</li>
	<li>قم بتسخين وسادة التدفئة مسبقا وضعها تحت مخاريط الأنف لنظام التخدير الذي سيتم استخدامه لتوصيل الأيزوفلوران. ضع وسادة ماصة نظيفة فوق وسادة التدفئة.</li>
	<li>ضع الفئران في غرفة الحث في نظام التخدير وقم بالتخدير بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران. عندما تفقد الفئران وعيها ، والذي يتم التحقق منه عن طريق فقدان منعكس قرصة إصبع القدم ، انقلها إلى أقماع الأنف. تأكد من أن كل في وضع ضعيف ووضعه بشكل صحيح على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.</li>
	<li>قلل تركيز الأيزوفلوران إلى 2٪ للحفاظ على التخدير.</li>
	<li>ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف.</li>
	<li>خطوة اختيارية: إزالة شعر البطن. يجب إزالة الشعر الموجود في أسفل البطن إذا تم إجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي.
	<ol>
		<li>ضعي طبقة سخية من كريم إزالة الشعر ، مثل Veet ، على أدنى 1 بوصة مربعة من الفراء على البطن ، مع الحرص على عدم ملامسة الأعضاء التناسلية الخارجية. انتظر 3 دقائق.</li>
		<li>قم بإزالة الشعر عن طريق فرك المنطقة بإسفنجة جافة ، ثم استخدم إسفنجة رطبة لتنظيف البشرة. كرر مرة واحدة ، إذا لزم الأمر.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>قسطرة المثانة
	<ol>
		<li>قم بتليين قسطرة وريدية جديدة معقمة للأطفال 24 جم باستخدام جل ترحيم غير مهيج مثل K-Y. قم بإزالة الإبرة والتخلص منها. إذا كان تسرب السوائل حول القسطرة مشكلة شائعة ، أي. يحدث بشكل متكرر أكثر من واحد من عشرة فئران ، يمكن استخدام قسطرة أكبر (20 جم). قد يكون هذا اعتبارا مهما في الفئران التي يزيد عمرها عن 8 أسابيع.</li>
		<li>أمسك محور القسطرة ، استخدم الإبهام والسبابة في يدك المعاكسة لنشر الأرجل الخلفيتين للفأر وفضح صماخ مجرى البول. أدخل القسطرة برفق في مجرى البول بزاوية 45 درجة ، مع تغيير الزاوية إلى واحدة موازية للمقعد لإدخالها بالكامل.</li>
		<li>بعد الإدخال الكامل ، ارفع القسطرة برفق ، مع إبقائها موازية للمقعد ، وتأكد بصريا من وضعها في مجرى البول وليس المهبل الموجود تحتها. إذا تم وضعها بشكل صحيح ، فسيكون من الممكن إدخال القسطرة بالكامل لأن المهبل أقصر من مجرى البول.</li>
		<li>تقليل تركيز الأيزوفلوران إلى 1٪.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>قم بتوصيل طرف بماصة P200 وإزالة البول من المثانة عن طريق تطبيق الشفط على الطرف الخارجي للقسطرة. قم بإزالة أي بول متبقي من محور القسطرة. تخلص من البول واترك القسطرة في مكانها.</li>
	<li>ضع ماصة 80 ميكرولتر بعناية من محلول التربسين 0.125٪ في محور القسطرة، مع تجنب فقاعات الهواء. قم بتوصيل حقنة مملوءة بالهواء سعة 1 مل بمحور القسطرة واضغط ببطء على المكبس 0.1-0.2 مل لتوصيل التربسين إلى المثانة.</li>
	<li>اترك مجموعة المحقنة والقسطرة في مكانها لمدة 15 دقيقة. كرر الخطوات 1.8-1.11 لأي من الفئران المخدرة المتبقية (حتى 4). انتقل إلى الخطوة التالية خلال فترة الانتظار. تلميح: في البداية قد يكون من المفيد أن يقوم شخص آخر بإعداد الخلايا (الخطوة 1.12).</li>
	<li>تحضير خلايا MB49 للزرع. تم طلاء الخلايا بمعدل 1 × 106 لكل قارورة T-25 قبل 48 ساعة من الزرع (الخطوة 1.1).
	<ol>
		<li>قم بإزالة الوسائط وأضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين إلى القارورة. عند فصل الخلايا ، أضف 5 مل من DMEM الكامل لإعادة تعليق الخلايا. قم بإزالة 50 ميكرولتر من الكمية للعد ، وقم بالطرد المركزي للباقي عند 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. وخلال خطوة الطرد المركزي، استمر في الخطوتين 1-12-2 و1-12-3.</li>
		<li>عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. احسب الخلايا / مل. ثم احسب الحجم اللازم لرفع حبيبات الخلية إلى 4 × 106 خلايا / مل (2 × 105 خلايا لكل 50 ميكرولتر).</li>
		<li>اسكب المادة الطافية من الخلايا ذات الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط قاعدة DMEM باستخدام الحجم المطلوب لتعليق الخلايا إلى 4 × 106 خلايا / مل (كما هو محسوب في الخطوة 1.12.2). احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>عند الوصول إلى النقطة الزمنية البالغة 15 دقيقة لعلاج التربسين للمثانة ، افصل المحقنة المملوءة بالهواء عن القسطرة تاركة القسطرة في مكانها. عادة ما يتدفق التربسين المستهلك مرة أخرى عبر القسطرة. قم بإزالة أي تربسين متبقي من المثانة عن طريق الشفط باستخدام ماصة P200 كما في الخطوة 1.9 أعلاه وتخلص منها.</li>
	<li>قم بإدخال 50 ميكرولتر من معلق الخلايا MB49 على الفور في محور القسطرة. قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالهواء سعة 1 مل بمحور القسطرة وتوصيل الخلايا إلى المثانة عن طريق الضغط ببطء على المكبس 0.1-0.2 مل. كرر هذه الخطوة حتى أربع مرات إضافية لزرع الفئران الخمسة جميعها. تجاهل أي خلايا غير مستخدمة.</li>
	<li>عند ترك مجموعة القسطرة والحقنة في مكانها ، اسمح للخلايا بالبقاء في المثانة لمدة 50 دقيقة.</li>
	<li>اسحب مجموعة حقنة القسطرة برفق من مجرى البول. اقلب تركيز الأيزوفلوران إلى الصفر وحرك كل فأر بوصة أو اثنتين بعيدا عن مخروط الأنف للتعافي على وسادة التسخين.</li>
	<li>عندما يستعيد الفأر منعكس الصحيح ، أعده إلى قفصه.</li>
</ol>
< ص الفئة = "jove_title">2. التوصيل داخل المثانة للفيروس الغدي (بعد 8 أيام من زرع الخلايا)
 CAUTION: يستخدم هذا الجزء من البروتوكول الفيروس الغدي ، وهو عامل معدي ويجب التعامل معه وفقا لإرشادات BSL2 الصارمة (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي يتم إجراؤها باستخدام العوامل المعدية من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة ساوث كارولينا الطبية.
<ol>
	<li>بعد ثمانية أيام من زرع الفئران بخلايا MB49 ، تحقق من وجود بيلة دموية. التقط الحيوانات الفردية فوق قطعة بيضاء من الورق الماص واضغط برفق على البطن لمسح قطرات البول على الورق. يشير البول الوردي إلى الأحمر إلى البيلة الدموية وهو علامة على ظهور الأورام. معدل أخذ الورم لا يقل عن 80٪ وبتقنية ممتازة يمكن أن يصل إلى 100٪.</li>
	<li>قم بإذابة مخزون الفيروسات الغدية على الجليد وتخفيفه إلى 109 PFU / 50 ميكرولتر (2 × 1010 PFU / مل) في PBS معقم بدرجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تخدير الفئران كما هو موضح في الخطوات 1.3-1.6 أعلاه.</li>
	<li>قسطرة الفئران كما هو موضح في الخطوة 1.8 وإزالة البول كما في الخطوة 1.9</li>
	<li>بعد إزالة البول ، قم على الفور بوضع 50 ميكرولتر من تعليق الفيروس في محور القسطرة. قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالهواء سعة 1 مل بمحور القسطرة وتوصيل الفيروس إلى المثانة عن طريق الضغط ببطء على المكبس 0.1-0.2 مل.</li>
	<li>ترك مجموعة القسطرة والحقنة في مكانها ، اترك الفيروس يسكن في المثانة لمدة 40 دقيقة.</li>
	<li>اسحب مجموعة حقنة القسطرة برفق من مجرى البول ، وتخلص منها في محلول مبيض بنسبة 10٪ لتعطيل أي فيروس متبقي.</li>
	<li>اقلب تركيز الأيزوفلوران إلى الصفر وحرك كل فأر بوصة أو اثنتين بعيدا عن مخروط الأنف للتعافي على وسادة التسخين.</li>
	<li>عندما يستعيد الفأر منعكس الصحيح ، أعده إلى قفصه.</li>
	<li>ضع علامة على الأقفاص للإشارة إلى أن الفئران قد غرست بالفيروسات الغدية. سيتم إلقاء الفيروس في فراش القفص لعدة أيام ويجب التعامل مع جميع الأقفاص والفراش وتطهيرها بشكل مناسب.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer.+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2012.</a> CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).</li>
<li>Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev.+Res%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev. Res. 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+heparin+binding+growth+factor+in+mouse+bladder+tumors+and+urine+from+mice+with+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer.</a> Cancer Res. 46 (11), 5507-5510 (1986).</li>
<li>De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+type+C+in+the+mouse+bladder+carcinoma+cell+line+MBT-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2.</a> J. Urol. 163 (6), 1999-2001 (2000).</li>
<li>Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+invasive+orthotopic+bladder+cancer+model+with+high+cathepsin+B+activity+resembling+human+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer.</a> J. Urol. 182 (2), 749-755 (2009).</li>
<li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo%3A+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic%2C+orthotopic%2C+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101 (1), 120-124 (2008).</li>
<li>Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+implantation+by+intravesical+gemcitabine+in+a+murine+model+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer.</a> J. Urol. 174 (3), 1115-1118 (2005).</li>
<li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter.+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin.</a> Cancer Res. 10 (20), 6977-6984 (2004).</li>
<li>Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+cytokine+gene+therapy+on+an+orthotopic+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model.</a> Clin. Cancer Res. 9 (12), 4522-4528 (2003).</li>
<li>Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+antitumor+activity+of+vinflunine+than+vinorelbine+against+an+orthotopic+murine+model+of+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder.</a> Urol. Oncol. 7 (4), 159-166 (2002).</li>
<li>Bohle, A., Jurczok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bladder+carcinoma+cell+adhesion+by+oligopeptide+combinations+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in.</a> 167 (1), 357-363 (2002).</li>
<li>Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59 (12), 2834-2837 (1999).</li>
<li>Gunther, J. H., Frambach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetylic+salicylic+acid+and+pentoxifylline+on+the+efficacy+of+intravesical+BCG+therapy+in+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> J. Urol. 161 (5), 1702-1706 (1999).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+microenvironment+modification+during+progression+of+murine+orthotopic+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer.</a> Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684(2011).</li>
<li>Seow, S. W., Cai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+rhamnosus+GG+induces+tumor+regression+in+mice+bearing+orthotopic+bladder+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors.</a> Cancer Sci. 101 (3), 751-758 (2009).</li>
<li>Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+therapy+is+superior+to+BCG+in+an+orthotopic+bladder+cancer+model+and+generates+CD4%2B+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity.</a> J. Immunother. 31 (1), 34-42 (2008).</li>
<li>Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AdCD40L+gene+therapy+counteracts+T+regulatory+cells+and+cures+aggressive+tumors+in+an+orthotopic+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model.</a> Clin. Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).</li>
<li>Loskog, A., Ninalga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+MB49+mouse+bladder+cancer+model+for+adenoviral+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy.</a> Lab Anim. 39 (4), 384-393 (2005).</li>
<li>Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Interleukin-10R1+Monoclonal+Antibody+Enhances+Bacillus+Calmette-Guerin+Induced+T-Helper+Type+1+Immune+Responses+and+Antitumor+Immunity+in+a+Mouse+Orthotopic+Model+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer.</a> J. Urol. 187 (6), 2228-2235 (2012).</li>
<li>Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin%2C+but+not+Prima-1%2C+decreased+tumor+cell+proliferation+in+the+syngeneic+murine+orthotopic+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics%22%5BJournal%5D)">Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model.</a> Clinics. 66 (12), 2121-2124 (2011).</li>
<li>Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Braz.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int. Braz. J. Urol. 34 (2), 220-226 (2008).</li>
<li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li>
<li>Zhang, Z., Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+SA-sCD40L+in+the+orthotopic+model+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer.</a> Acta Oncol. 50 (7), 1111-1118 (2011).</li>
<li>Kohno, S., Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+mutant+HF10+oncolytic+viral+therapy+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer.</a> Urology. 66 (5), 1116-1121 (2005).</li>
<li>Kikuchi, E., Menendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+for+bladder+cancers+by+intravesically+administered+replication-competent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors.</a> Clin. Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).</li>
<li>Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+transfer+efficiency+by+viral+vectors+to+murine+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium.</a> J. Urol. 165 (2), 667-671 (2001).</li>
<li>Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+viral+vectors%3A+gene+transfer+efficiency+and+tissue+specificity+in+a+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model.</a> J. Urol. 170 (3), 979-984 (2003).</li>
<li>Black, P. C., Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106 (11), 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

المنهجية الأساسية الموضحة في هذا البروتوكول هي قسطرة مثانة الفأر ، والتي لها تطبيقات واسعة لتقطير الخلايا أو أي عامل مخصص للتوصيل الموضعي إلى ظهارة المثانة. تم تحسين البروتوكول المحدد الموضح أعلاه للدراسات قصيرة الأجل (~ 10 أيام). يعد زرع العدد الدقيق للخلايا أمرا بالغ الأهمية ، لأن عدد الخلايا الأعلى سيؤدي إلى نمو أسرع للورم وربما فقدان بسبب عبء الورم الكبير. قد يتطلب استخدام 200,000 خلية MB49 للتقطير القتل الرحيم لما يصل إلى 25٪ من بحلول اليوم 14 بسبب عبء الورم المفرط. في تجربتنا ، لا تتأثر الفئران سلبا بحمل الورم في غ...

سرطان المثانة هو ثاني أكثر أنواع السرطان شيوعا في الجهاز البولي التناسلي مع ما يقرب من 75,000 حالة جديدة و 15,000 حالة وفاة متوقعة في عام 20121. تتطلب معدلات التكرار العالية متابعة مدى الحياة ، مما يجعل سرطان المثانة أحد أكثر أنواع السرطان تكلفة للعلاج. قد ينتقل سرطان المثانة الذي غزا الطبقة العضلية إلى الكبد أو الرئة أو العظام عبر الجهاز اللمفاوي. ينتج عن العلاج متعدد الوسائط للأورام المتقدمة 20-40٪ فقط من البقاء على قيد الحياة بعد 5 سنوات. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات العلاج الفعالة التي تهدف إلى الحد من تكرار وتطور سرطان المثانة السطحي بالإضافة إلى تحسين النتائج العلاجية في المرضى الذين يعانون من مرض متقدم.
يتطلب تطوير علاجات جديدة نماذج قبل السريرية لتقييم الفعالية بعد التقييم الأولي في المختبر. يمكن أن تؤثر البيئة المكروية للورم بشكل كبير على تطور السرطان واستجابته ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى نماذج قبل السريرية التي تنشأ فيها الأورام أو يمكن إنشاؤها في العضو الأصلي. يتمثل أحد الأساليب في تطوير نماذج معدلة وراثيا تنشأ فيها الأورام تلقائيا أو يمكن إحداثها بطريقة خاصة بالأعضاء. تم مؤخرا نشر بروتوكول ممتاز لنموذج سرطان المثانة المعدل وراثيا2. عيب النماذج المعدلة وراثيا هو أن الأورام تميل إلى التطور ببطء وبأقل توحيدا مما هو مرغوب فيه. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراعاة تكلفة الحفاظ على مستعمرة التكاثر. بديل للنماذج المعدلة وراثيا هو زرع الخلايا السرطانية لتقويم العظام ، والذي يتميز بالأطر الزمنية القصيرة لإنشاء الورم في الفئران المتاحة تجاريا. في حين أن بعض خطوط خلايا سرطان المثانة البشرية يمكن زراعتها بشكل تقويمي (استخدمنا UM-UC-3 بنجاح) ، فقد يكون من المرغوب فيه إنشاء أورام في الفئران ذات الكفاءة المناعية. خطان من خطوط خلايا سرطان المثانة الفئرانية ، والتي تنمو بشكل تقويمي هما MBT-2 و MB493. نظرا لأن خلايا MBT-2 ملوثة بتكرار الفيروس القهقري من النوعC 4 ، فقد اخترنا خلايا MB49 لدراساتنا. من المهم ملاحظة أن خلايا MB49 تم عزلها من فأر ذكر وأن عمليات زرع تقويم العظام لأسباب تشريحية يتم إجراؤها في إناث الفئران. هذا له فائدة سهولة التعرف على الخلايا المزروعة من خلال علامات كروموسوم Y ، ولكن عدم التطابق بين الجنسين يمكن أن يكون عيبا في الدراسات المناعية.
ظهارة المثانة مبطنة بطبقة جليكوزامينوجليكان (GAG) ، والتي تعمل كحاجز للعدوى بالكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن يتداخل هذا الحاجز أيضا مع زرع الخلايا السرطانية وقد تم تطوير عدة طرق للتغلب على هذه الصعوبة (الجدول 1). تم استخدام الكي الكهربائي على نطاق واسع كوسيلة فيزيائية لتعطيل طبقة GAG 5-13 وتم مؤخرا نشر بروتوكول يوضح الكي الكهربائي في JoVE14. ومع ذلك ، في حالة عدم توفر وحدة الكي الكهربائي ، يمكن أيضا استخدام الوسائل الكيميائية لتدمير طبقة GAG مثل نترات الفضة أو بولي إل ليسين15-24. يتم إنشاء الأورام بشكل فعال من خلال التعرض لفترة وجيزة للمثانة لحجم صغير من نترات الفضة (5-10 ميكرولتر ، 0.15-1.0 م ، ~ 10 ثوان) أو ملامسة أطول مع بولي إل ليسين (100 ميكرولتر من 0.1 مجم / مل لمدة 20 دقيقة) (الجدول 1). نصف هنا طريقة تستخدم التربسين لتسهيل زرع خلايا MB49.
 في محاولة لتحسين الأساليب العلاجية لسرطان المثانة ، حظي العلاج الجيني باهتمام كبير. من وجهة نظر سريرية ، يعد سرطان المثانة هدفا مثاليا للعلاج الجيني نظرا لسهولة الوصول إلى العضو والقدرة على توصيل الحمولة محليا. تشمل النواقل الفيروسية التي تم استكشافها للعلاج الجيني لسرطان المثانة فيروس الهربس البسيطالورمي 25 ، والفيروسالقهقري 26 ، وفيروس الجدريالكناري 27 ، وفيروس اللقاح ، و AAV ، والفيروسالغدي 28. في الجزء الثاني من بروتوكولنا ، نصف طريقة لإيصال الفيروس مطابقة تقريبا لتقطير الخلايا السرطانية. من المثير للاهتمام في مختبرنا تطوير مناهج جديدة لتوصيل الجينات ، والتي نقوم بتقييمها عن طريق التلألؤ البيولوجي باستخدام ناقل فيروسي غدي يعبر عن جين متحول لوسيفيراز. ومع ذلك ، يمكن استخدام منهجية قسطرة المثانة لتوصيل عوامل مختلفة وبالتالي لها قابلية تطبيق واسعة.

<table><tbody><tr><td> < ص>اسم الكاشف < / ص > </td><td>الشركة</td> <td>< ص > رقم الكتالوج < / ص ></td><td> < ص > التعليقات < / ص > </td></tr><tr><td> < ص>6-8 أسابيع من العمر فئران < / ص > </td><td>مختبرات جاكسون</td> <td>< ص > اسم السلالة: C57BL / 6J رقم السهم: 000664< / ص ></td><td> < ص >< / ص </td></tr><tr><td> > < ص > التربسين * < / ص > </td><td>MediaTech</td><td>MT25-053-CI</td><td> تم الحصول عليها من خلال Fisher </td></tr><tr><td> DMEM * </td><td>MediaTech</td><td>MT10-017-CV</td><td> تم الحصول عليها من خلال Fisher </td></tr><tr><td> FBS </td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td> Heat-inactivated </td></tr><tr><td> T25 قوارير* </td><td>Corning Costar</td><td>< ص>رقم كورنينج: 3056< / ص > < ص > فيشر: 07-200-63 < / ص ></td><td> < ص > تم الحصول عليها من خلال خلايا فيشر < / ص > </td></tr><tr><td> < ص > ميغابايت 49 خلايا< / ص > </td><td>N / A</td> <td> N / A </td><td> تم الحصول عليها من الدكتور بوهلي (انظر المرجع 11 ) </td></tr><tr><td> Puralube Vet Ointment * </td><td>Pharmaderm</td><td>< ص>شركة هنري شاين< / ص> < ب> رقم: 036090-6050059 < / ص > < ص > فيشر: NC9676869< / ص ></td><td> < ص>تم الحصول عليها من خلال فيشر < / ص </td></tr><tr><td> > < > كريم مزيل الشعر: Veet </td><td>صيدلية</td> <td>محلية < ص >< / ص ></td><td> < ص >< / ص > </td></tr><tr><td> < ص>زيوت التشحيم: < / ص > < ص > كي واي جيلي < / ص > </td><td>الصيدلية المحلية</td> <td>< ص >< / ص ></td><td> < ص >< / ص > </td></tr><tr><td> < ص > القسطرة * < / ص > </td><td>إكسل الدولية</td> <td>< ص > إكسل الدولية < ص > < ص > رقم : 26751 ؛ < / ص > < ص > فيشر: 14-841-21 < / ص ></td><td> < ص > تم الحصول عليها من خلال فيشر < / ص > </td></tr><tr><td> < ص > إيزوفلوران < / ص > </td><td>تيريل</td> <td>< ص > NDC 66794-011-25 < / ص ></td><td> < ص > تم الحصول عليها من خلال صيدلية المستشفى < / ص > </td></tr><tr><td> < ص > 1 مل محاقن السل < / ص > </td><td>بكتون ديكنسون</td> <td>< ص >BD309659< / ص > < ص > فيشر: 14-823-434 < / ص></td><td> < ص >< / ص > </td></tr><tr><td> < ص > د-لوسيفيرين < / ص > </td><td>جولد بيوتكنولوجيز</td> <td>< ص > L-123-1 < / ص ></td><td> < ص >< / ص > </td></tr><tr><td> < ص > Ad-CMV-Luc < / ص > </td><td>VectorBiolabs</td> <td>< ص > 1000 ؛ طلب تضخيم واسع النطاق وتنقية CsCl ل in vivo use</td><td> Infectious Factor الذي يتطلب احتواء BSL2 </td></tr><tr><td> Steady-Glo&nbsp; نظام فحص لوسيفيراز < / ص > </td><td>Promega</td> <td> E2510 (10 مل) ، E2520 (100 مل) ، أو E2550 (10 × 100 مل) < / ص ></td><td> </td></tr><tr><td colspan = "4" > * متاح من خلال بائعين متعددين </td></tr><tr> < td colspan = "4" > EQUIPMENT</td></tr><tr><td> نظام التخدير </td><td>أنظمة EZ ، </td> نظام <td>التخدير Euthanex Corporation: جهاز إعادة تنفس الماوس EZ7000 5 منافذ: EZ109</td><td> تم الحصول عليها من خلال Fisher </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 200 </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm</td><td> </td></tr><tr><td> FLUOstar Optima </td><td>بي إم جي لابتك</td><td>< ب>http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2< ص></td><td> <ص></ص> </td></tr></tbody></table>

وسرطان المثانة نموذج مثلي للدراسات توصيل الجينات

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

سرطان المثانة هو ثاني أكثر أنواع السرطان شيوعا في الجهاز البولي التناسلي وهناك حاجة إلى طرق علاجية جديدة يمكن أن تقلل من التكرار والتقدم. يمكن أن تؤثر البيئة المكروية للورم بشكل كبير على تطور الورم والاستجابة للعلاج. لذلك غالبا ما يكون من المستحسن زراعة الخلايا السرطانية في العضو الذي نشأت منه. يصف هذا البروتوكول نموذجا تقويميا لسرطان المثانة ، حيث يتم غرس خلايا سرطان المثانة الفئرانية MB49 في المثانة عن طريق القسطرة. يتطلب زرع الخلايا السرطانية الناجح في هذا النموذج تعطيل طبقة الجليكوزامينوجليكان الواقية ، والتي يمكن تحقيقها بالوسائل الفيزيائية أو الكيميائية. في بروتوكولنا ، يتم علاج المثانة بالتربسين قبل تقطير الخلايا. يمكن أيضا استخدام قسطرة المثانة لتقديم العلاجات بمجرد إنشاء الأورام. يصف هذا البروتوكول توصيل بنية الفيروسية الغدية التي تعبر عن جين مراسل لوسيفيراز. بينما تم تحسين بروتوكولنا للدراسات قصيرة المدى ويركز على توصيل الجينات ، فإن منهجية قسطرة المثانة الفأرية لها تطبيقات واسعة.

يُلاحظ وجود بيلة دموية في جميع الفئران تقريبًا خلال 8 أيام بعد زراعة 200,000 خلية من نوع MB49. وكما هو موضح في الشكل 1، يتضاعف وزن المثانة بأكثر من مرتين من 34.7±3.3 mg (المدى 31-37 mg، n=4) في الفئران غير الحاملة للأورام إلى 87.5±19.2 mg (المدى 77-120 mg، n=10) في الفئران التي زُرعت فيها خلايا MB49. وفيما يتعلق بنقل الجينات، وجدنا أن تصوير الفئران بعد 24 ساعة من التقطير الفيروسي يعطي إشارة أقوى مما يعطيه بعد 48 ساعة (الشكل 2). يتفاوت النقل الفيروسي الغدي بشكل كبير بين الحيوانات، وهو أمر...

يمكن أن يكون زرع الخلايا السرطانية في العضو الأصلي بمثابة نموذج ما قبل السريري المفيد لتقييم العلاجات الجديدة. يمكن زراعة خلايا سرطان المثانة MB49 داخل المثانة بعد التقطير داخل المثانة. يوضح هذا البروتوكول قسطرة مثانة الفأر لغرض زرع الورم وتوصيل الفيروسات الغدية.

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أورام في مثانات الفئران بشكل متسق وسريع، والتي يمكن استخدامها لاحقاً لاختبار علاجات سرطان المثانة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق غرس خلايا سرطانية في مثانات الفئران باستخدام القسطرة. وبعد ثمانية أيام، تُكرر عملية القسطرة لغرس فيروس غداني (adenovirus) يعبر عن جين مراسل للوسيفيراز (luciferase reporter gene).بعد ذلك بـ 24 ساعة، يتم قياس التعبير الجيني الفيروسي باستخدام مقايسة لوسيفيريز. يتم الحصول على نتائج توضح الظروف التي يمكن من خلالها تحقيق التعبير الجيني الأمثل. يُعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات القسطرة والتركيب يصعب تعلمها، ونظراً لاحتمالية حدوث ضرر للمثانة أو تسبب تسرب للمادة المحقونة.قبل يومين من إجراء زرع الخلايا في دوارق T 25، يتم استزراع 1 × 10⁶ من خلايا MB 49 في وسط DMEM عالي الجلوكوز مضاف إليه 10% FBS في اليوم المحدد للإجراء. قم بتحضير التريبسين لعملية الفصل باستخدام وسط DMEM الأساسي لتخفيف التريبسين المعقم بتركيز 0.25% المخصص للمزارع النسيجية. ضع المحلول في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C حتى يتساوى حرارياً، وقم بتسخين وسادة تدفئة مسبقاً ووضعها أسفل الأقماع الأنفية لنظام التخدير الذي سيُستخدم لإعطاء isof fluorine.ضع وسادة امتصاص نظيفة فوق وسادة التسخين بعد تخدير الفئران باستخدام 3% isof fluorine. قم بإجراء قرصة لإصبع القدم للتحقق من مستوى التخدير. ضع الفئران في وضعية الاستلقاء الظهري على وسادة التسخين وثبّت قمع الأنف الذي يحتوي على 2% isof fluorine.استخدم جل تشحيم غير مهيج لتشحيم قسطرة وريدية للأطفال جديدة ومعقمة بمقاس 20 4G. بعد ذلك، قم بإزالة الإبرة التي تثبت محور القسطرة وتخلص منها. استخدم إبهام وسبابة يدك الأخرى لمباعدة الأطراف الخلفية للفأر وكشف مخاطية الإحليل.أدخل القسطرة برفق في الإحليل بزاوية 45 درجة، مع تغيير الزاوية لتصبح موازية لمنضدة العمل لإدخالها بالكامل بعد الإدخال التام. ارفع القسطرة برفق مع إبقائها موازية للمنضدة، وتحقق بصرياً من وضعها في الإحليل وليس في المهبل الموجود أسفله. كرر العملية مع بقية الفئران المخدرة.بعد ذلك، قم بخفض تركيز isof fluorine إلى 1%. قم بتركيب طرف في ماصة P 200 وقم بإزالة البول من المثانة عن طريق تطبيق الشفط على الطرف الخارجي للقسطرة. أزل أي بول متبقٍ من محور القسطرة، ثم تخلص من البول واترك القسطرة في مكانها. قم بسحب 80 µL من محلول trips الدافئ بعناية بواسطة الماصة وضعه في محور القسطرة، مع تجنب تكون فقاعات الهواء.قم بتوصيل محقنة مملوءة بالهواء سعة 1 CC بوصلة القسطرة واضغط المكبس ببطء. يتم حقن 0.1 إلى 0.2 ccs لإيصال الـ trypsin إلى المثانة. اترك تجميعات المحقنة والقسطرة في مكانها لمدة 15 دقيقة.لتحضير الخلايا للزرع، قم بإزالة الوسط من خلايا MB 49 التي تم استزراعها مسبقاً، وأضف 500 µL من trypsin بتركيز 0.25% إلى القارورة. وعندما تنفصل الخلايا، أضف 5 mL من DMEM الكامل لإعادة تعليق الخلايا؛ ثم اسحب عينة حجمها 50 µL لعدّ الخلايا، وقم بطرد المركزات للمتبقي بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق بينما يتم تدوير الخلايا.استخدم مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لعد الخلايا وحساب عدد الخلايا لكل مليلتر، بالإضافة إلى حجم الوسط اللازم لإيصال كريّة الخلايا إلى 4 × 10⁶ خلية لكل لتر. صب السائل الطافي من الخلايا التي تم طردها مركزياً، ثم أعد تعليق الكريّة في وسط DMEM الأساسي.احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة. بعد المعالجة بـ tripsin لمدة 15 دقيقة، افصل حقنة airfield عن القسطرة مع ترك القسطرة في مكانها. استخدم ماصة P 200 لإزالة أي tripsin متبقٍ من المثانة عن طريق الشفط والتخلص منه فوراً، ثم اسحب 50 µL من معلق خلايا MB 49 في مركز القسطرة.بعد ذلك، قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالهواء سعة 1 cc بوصلة القسطرة، ثم قم بإيصال الخلايا إلى المثانة عن طريق الضغط ببطء على المكبس بمقدار 0.1 إلى 0.2 cc، مع ترك مجموعة القسطرة والمحقنة في مكانها.اترك الخلايا في المثانة لمدة 50 دقيقة. بعد ذلك، اسحب مجموعة سرنجة القسطرة برفق من الإحليل. قم بخفض تركيز isof fluorine إلى 0% واترك الفئران لتتعافى من التخدير على وسادة التسخين.عندما يستعيد الفأر منعكس الكتابة، أعده إلى قفصه. تنبيه، يستخدم هذا البروتوكول الفيروس الغدي (adenovirus)، وهو عامل معدٍ يجب التعامل معه وفقاً لإرشادات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (BSL two) الصارمة. وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت باستخدام العوامل المعدية من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية في جامعة جنوب كارولاينا الطبية.بعد ثمانية أيام من زرع خلايا MB 49 في الفئران، يتم التحقق من وجود بيلة دموية عن طريق وضع كل حيوان على قطعة بيضاء من الورق الماص والضغط برفق على البطن لتنقيط قطرات البول على الورق. يشير البول الذي يتراوح لونه من الوردي إلى الأحمر إلى وجود بيلة دموية، وهي علامة على استقرار الأورام. قم بإذابة مخزون الفيروسات الغدانية على الجليد واستخدم محلول PBS المعقم في درجة حرارة الغرفة لتخفيفه إلى 10⁹ pfu لكل 50 µL. بعد تخدير الفئران وقسطرتها وسحب البول كما تم وصفه سابقاً في هذا الفيديو، قم فوراً بسحب 50 µL من معلق الفيروس باستخدام الماصة ووضعه في مركز القسطرة، ثم قم بتوصيل حقنة مملوءة بالهواء واضغط على المكبس لإيصال الفيروس إلى المثانة. مع ترك مجموعة القسطرة والحقنة في مكانها، اترك الفيروس في المثانة لمدة 40 دقيقة.ثم اسحب مجموعة القسطرة والمحقنة برفق من الإحليل وتخلص منها في محلول مبيض بتركيز 10% لتعطيل أي فيروسات متبقية. اترك الفأر حتى يفيق من التخدير قبل إعادته إلى القفص، وضع علامات على الأقفاص للإشارة إلى أن الفئران قد حُقنت بالفيروس الغدي؛ حيث سيتم طرح الفيروس في فرش القفص لعدة أيام، ويجب التعامل مع جميع الأقفاص والفرش وتطهيرها بشكل مناسب. يلاحظ وجود دم في البول (Hematuria) في جميع الفئران تقريبًا خلال ثمانية أيام بعد زرع 200,000 من خلايا MB 49 كما هو موضح هنا.يزداد وزن المثانة لأكثر من الضعف، حيث يرتفع من 34.7 ± 3.3 milligrams في الفئران غير الحاملة للأورام إلى 87.5 ± 19.2 milligrams في الفئران التي تم زرع خلايا MB 49 فيها. وفيما يتعلق بإيصال الجينات، فإن تصوير الفئران بعد 24 ساعة من التثبيت الفيروسي يعطي إشارة أقوى مما يعطيه بعد 48 ساعة. ويتسم الإيصال الفيروسي الغدي بتفاوت كبير بين الحيوانات، وهو أمر يجب مراعاته عند تخطيط حجم المجموعة لأغراض إحصائية.في حال عدم توفر نظام تصوير للحيوانات الصغيرة، فإن النهج البديل لقياس تعبير الجين المنقول للوسيفرين هو استئصال المثانة وتجانسها لإجراء تحليل مخبري كما هو موضح هنا. وتُظهر المقارنة بين التحليل داخل الجسم الحي باستخدام نظام IVUS 200 للحيوانات الصغيرة والتحليل المخبري باستخدام مجموعة steady glow ارتباطاً ممتازاً بين مجموعات البيانات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تركيب قسطرة في مثانة الفأر وحقن الخلايا الورمية أو العوامل العلاجية.

an-orthotopic-bladder-cancer-model-for-gene-delivery-studies

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

تنشأ أورام المثانة في إناث الفئران بطريقة مينيملي من خلال قسطرة ، الكي المحلية ، والتصاق الخلايا السرطانية لاحقا الى مواقع الحرق.

نموذج مثلي من سرطان المثانة الفئران

إنشاء ورم المثانة orthotopic نموذج لتقييم آثار antitumor من سارنا تسليم intravesically ونمو الورم الرصد بواسطة الموجات فوق الصوتية والتصوير bioluminescent.

ورم في المثانة Orthotopic النموذجي وتقييم المعالجة سارنا داخل المثانة

في هذا الفيديو ، نصف عملية زرع تقويم العضيات لورم المثانة المزروعة في مثانة الفئران لدراسة دور بيئة الأعضاء في تطوير الأورام.

النموذج العضوي لورم المثانة: طريقة لزرع عضيات المثانة في مثانة الفئران المتلقية

في هذا الفيديو ، نصف الإجراء داخل المثانة لتوصيل الخلايا السرطانية إلى مثانة نموذج الفأر. يساعد هذا الإجراء في إنشاء نموذج ورم المثانة التقويمي الذي يمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات علاجية.

نمذجة ورم المثانة التقويمي في نموذج الفأر: إجراء للإعطاء داخل المثانة للخلايا السرطانية في مثانة الفئران

تقنية أنشئت لتطعيم الغازية مثلي xenografts سرطان المثانة الأولية يتطلب فتح البطن وتعبئة المثانة. هذا الإجراء يلحق قسط كبير من المراضة على الفئران، هي صعبة وتستغرق وقتا طويلا من الناحية الفنية. لذا قمنا بتطوير الدقة العالية، عن طريق الجلد باستخدام نهج توجيه الموجات فوق الصوتية.

مؤسسة المناظير الفئران مثلي المثانة Xenografts

يصف هذا البروتوكول جيل من الفئران أورام المثانة مثلي في الإناث C57BL / 6J الفئران ورصد نمو الورم.

والفئران مثلي المثانة نموذج ورم والورم نظام لكشف

يصف لنا طريقة جديدة لإيصال بلازميد الحمض النووي في خلايا urothelial الماوس المثانة في فيفو عن طريق قسطرة مجرى البول وانهانسر. يوفر طريقة سريعة وملائمة لتوليد نماذج الماوس أصلي من أمراض المثانة.

أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر

يصف هذا البروتوكول توليد نماذج xenograft المتقوّدة من قبل المريض من خلال غرس خلايا سرطان الخلايا البولية عالية الجودة أو خلايا سرطان القولون والمستقيم داخل المستقيم في مرض السكري غير البدين / شديد مجتمعة الفئران نقص المناعة (NOD / SCID) لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا اللمفية سترومال العقدة، والتي تحاكي تطور الأمراض النقيلية البشرية.

نماذج Xenograft المتوارثية المستمدة من المريض لسرطان الخلايا البولية البشرية ونمو ورم سرطان القولون والمستقيم وورم الانبثاث العفوي

يوفر هذا البروتوكول خطوات تجريبية مفصلة لإنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد في المختبر من organoids ورم المثانة المستمدة من سرطان المثانة الميورين الناجم عن مادة مسرطنة. يتم وصف أساليب الاستزراع بما في ذلك المرور والهندسة الوراثية وزرع العظام من organoids الورم.

الثقافة والتلاعب وزرع تقويم العظام من ورم المثانة الماوس Organoids

يصف هذا البروتوكول عملية توليد وتوصيف المواد العضوية البولية الفئران التي تؤوي عمليات حذف في الجينات ذات الاهتمام. وتشمل الطرق حصاد الخلايا البولية الثيلية للفئران ، والنقل خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي الذي يقود تعبير Cre مع مروج CMV ، وفي المختبر وكذلك في توصيف الجسم الحي .

السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية

اكتشف طريقة زراعة خلايا سرطان المثانة MB49 في فئران باستخدام القسطرة لاختبار العلاجات الجينية. يُقاس التعبير الجيني الفيروسي باستخدام تقنية اللوسيفيراز بعد 24 ساعة.

وسرطان المثانة نموذج مثلي للدراسات توصيل الجينات

استكشف المزيد من الفيديوهات