الوليد الصعق الكهربائي المنطقة Subventricular

الهدف من هذا الإجراء هو تسمية المكونات الجزيئية للخلايا الجذعية العصبية في المنطقة تحت البطينين ومعالجتها وراثيا. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال ماصة زجاجية محملة بالحمض النووي أولا في البطين الجانبي ل P zero P.والخطوة الثانية هي طرد الحمض النووي إلى السائل الشوكي الدماغي للبطين الجانبي. يتم تطبيق التيار التالي على P.يسمح هذا بنقل الحمض النووي إلى الخلايا الجذعية العصبية المبطنة للبطينين الجانبيين.

في النهاية ، يتم استخدام مجموعة من التقنيات الجزيئية ، بما في ذلك الكيمياء المناعية ، والبيولوجيا الجزيئية ، والفحص المجهري ، والفيزيولوجيا الكهربية ، لتصور التغيرات في المصير والانتشار والهجرة ونضج الخلايا الجذعية العصبية في المنطقة تحت البطينية. يمكن أن يساعد التثقيب الكهربائي للمنطقة تحت البطينية لحديثي الولادة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الخلايا العصبية ، مثل المسارات الجزيئية المسؤولة عن تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية العصبية وذريتها وتمايزها وهجرتها ونضجها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الفئران المعدلة وراثيا ، هي أنها تسمح بوضع العلامات السريعة والقوية للخلايا الجذعية العصبية في SVZ بطريقة فعالة من حيث الوقت وفعالة من حيث التكلفة.

أولا ، تأكد من أن الحمض النووي إلى التنقية الكهربائية ذو نقاء وتركيز عاليين وخالي من السموم الداخلية. اسحب أنابيب شعرية زجاجية من زجاج السيليكا المصقول بطول 10 سم في الماصات. يتم هنا استخدام مجتذب ماصة PP ثمانية 30 ghhi PC 10 لسحب سحب مرجح بخطوة واحدة عند 70.5 درجة مئوية بعد سحب الماصة ، استخدم ملقطا دائريا لكسر الحافة.

ثم افحص الماصة تحت مجهر تشريح للتأكد من عدم وجود حواف خشنة. إذا لزم الأمر ، يمكن شطف الطرف باستخدام حجر الطحن. بعد ذلك ، ضع الماصات المصبوبة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.

بمجرد انقضاء 15 دقيقة ، ضع علامة على الماصة على بعد ملليمترين من حافة الطرف بعلامة طرف دقيقة. أخيرا ، قم بإعداد محلول أخضر سريع بوزن 0.1 لكل حجم عن طريق خلط محلول ملحي معقم مفلتر بنسبة 0.9٪ مع تخدير أخضر جاف وسريع. جرو يبلغ من العمر صفر إلى يوم واحد ، طبق بتري زجاجي مبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية ويوضع على الجليد الغربي بعد خمس دقائق تقريبا ، حدد حالة التخدير باستخدام استجابة قرصة القدم.

في حالة عدم حدوث أي حركة ، ابدأ الحقن داخل البطينين. اجمع بين المحلول الأخضر السريع ومحلول الحمض النووي وقم بنقل ميكرولتر إلى ميكرولتر على الأغشية الحيوية. من المهم أن يتم ذلك قبل الحقن مباشرة حيث يمكن أن يؤدي الجمع بين المحلول الأخضر السريع والحمض النووي إلى التبخر والتبلور السريع مع الانسداد اللاحق للماصات الزجاجية، واستنشاق حجم الكمية بالكامل باستخدام حقنة ميكروفيلم وتحميل الماصة الزجاجية على حاقن ضغط الهواء.

الآن ، أمسك رأس الجرو برفق وامسكه بين الإبهام والسبابة من آخر يد مهيمنة. ثم قم بتشغيل المصباح وأمسك رأس الجرو خارج شعاع الضوء مباشرة. إذا لم يكن البطينان مرئيين بوضوح ، فقم بترطيب الرأس بمحلول ملحي معقم للمساعدة في تقليل كمية الضوء المنعكسة من فروة الرأس.

بعد ذلك ، باستخدام اليد المهيمنة ، أدخل الإبرة في البطين الجانبي الجانبي القريب. يجب أن يكون موقع الحقن على مسافة متساوية تقريبا من خياطة OID والعين ، ومليمترين جانبيين للخياطة السهمية. أدخل الماصة المسحوبة في علامة المليمترين للحصول على P zero pop ، والتي يجب أن تضمن الاختراق في البطين الجانبي.

قد يحدث الملء الخلفي للنخاعي في الماصة بسبب إطلاق الضغط داخل الجمجمة. إذا حدث هذا ، فقم بفك القبضة على رأس الملوثات العضوية الثابتة لتقليل الضغط والمساعدة في حقن البلازميد. بمجرد إدخال الماصة على النحو الأمثل ، قم بحقن ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من البلازميد في البطين الجانبي.

اضبط جهد مولد التشغيل الكهربائي لخمس نبضات مربعة ، و 50 مللي ثانية لكل نبضة ، و 100 فولت بفواصل زمنية قدرها 50 مللي ثانية. يتم إعطاء الخصوصية المكانية للتشغيل الكهربائي للبلازما من خلال اتجاه نقل الشحنة ، لذلك يجب إيلاء الاعتبار المكاني لوضع الأقطاب الكهربائية بالنظر إلى مدى تنوع خلايا SVZ. أبلغ الناس عن تغيرات من حيث مصير الخلية وتكاثرها في الظهر البطني لمواقع CAU.

بعد حقن تراجع البلازميد ، يتم تشغيل أقطاب الملقط في PBS لزيادة نقل الشحنة إلى أقصى حد والمساعدة في منع الحروق الناتجة عن المقاومة. بعد ذلك ، ضع القطب الموجب على الجدار الجانبي الظهري للجمجمة بالقرب من الأذن وقم بغمس الجانب إلى حقن السيتوبلازم. ثم ضع القطب السالب على الجانب الجانبي البطني لنصف الكرة الأرضية المقابل للأنف الفرقعة.

يوضح هذا الشكل الاتجاه الصحيح للأقطاب الكهربائية السالبة والموجبة فيما يتعلق بالمحور x و y و Z على الجرو المحقون. ابدأ نقل التيار بالضغط على دواسة تبديل القدم النبضية وقم بمسح الأقطاب الكهربائية من الظهرية إلى الجانبية باستخدام فواصل زاوية تبلغ حوالي 25 درجة. بمجرد اكتمال التثقيب الكهربائي ، ضع جميع الجراء المثقلة بالكهرباء على وسادة تسخين لمدة خمس دقائق.

قم بتدوير الجراء برفق كل 30 ثانية مع تحفيز خفيف. تظهر هذه الصورة البطين الجانبي لفأر حديثي الولادة بعد 24 ساعة من التثقيب الكهربائي لناقل ترميز EGFP. تتألق الخلايا المصنفة كهربائيا باللون الأخضر.

هنا نرى البطين الجانبي المسمى LV بعد 28 يوما من التثقيب الكهربائي ل Cree Recombinase و GFP الذي يشفر البلازميدات في الفئران التي تحمل رمز إيقاف في المنبع من إعادة تركيب طماطم TD يحفز التعبير عن طماطم TD التي تظهر باللون الأحمر ، والتخفيف المتتالي للبلازميد مما ينتج عنه عدد قليل من خلايا SVZ الإيجابية EGFP المتبقية أو طماطم TD المعبر عنها جينونيا. تخفيف البلازميد ، يظهر الحمض النووي الموضح باللون الأخضر بالنظر إلى أن المزيد من الخلايا في طبقة الخلايا الحبيبية للبصلة الشمية المسماة OB ، عبرت عن العلامة الجينومية TD الطماطم الموضحة باللون الأحمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الخلايا الجذعية ومعالجتها من SVZ.