خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقوش الخلايا مباشرة في البيئات المائية تماما. يتم تحقيق ذلك عن طريق إذابة البوليمرات طويلة السلسلة أولا ، مثل البولي إيثيلين جلايكول والدكسترين في أنابيب منفصلة تحتوي على وسط زراعة الخلايا. الخطوة الثانية هي tryps anize وحصاد الحبيبات وإعادة تعليق الخلايا بكثافة البذر المطلوبة في أحد محاليل البوليمر أو كليهما.

بعد ذلك ، يتم توزيع محاليل البوليمر على طبق زراعة الخلايا. يسمح عدم توافق البوليمرين بالزخرفة المكانية للسائلين المائي بالكامل. يمكن تضمين الخلايا إما في محلول البوليمر أو في كل من محاليل البوليمر لإنتاج مجموعة متنوعة من الأنماط.

الخطوة الأخيرة هي إزالة محاليل البوليمر بمجرد السماح للخلايا بالالتصاق لمدة أربع ساعات أو أكثر واستبدالها بوسط الاستزراع. في النهاية ، يمكن استخدام المجهر الساطع أو الفلوري لتأكيد زخرفة الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل طباعة التلامس الصغير ، هي أن الخلايا منقوشة في بيئة مائية تماما باستخدام أدوات بسيطة مثل أنماط الأنابيب الدقيقة.

يمكن استخدام هذه الطريقة لهندسة الأنسجة لتقييم هجرة الخلايا والتحقيق في إشارات الخلية إلى الخلية والإشارات الأوتوكرينية التي توضح أن الإجراءات ستكون أبراهام ، طالب جامعي ، وجوشوا وايت ، طالب دراسات عليا من مختبر تاكاياما. ابدأ بإذابة البوليمرين المختلفين في الوسط المحدد الذي سيتم استخدامه في تجاربك. في هذا المثال ، يبلغ عدد الأوزان الجزيئية للبولي إيثيلين جلايكول ، المعروف أيضا باسم PEG و Dextrin ، المعروف أيضا باسم Dex ، 35 كيلودالتون و 500 كيلودالتون على التوالي.

قم بإعداد 16 عينة ملليلتر في أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر ، لكل منها تركيزات مختلفة من PEG و dex ، على غرار الرسم البياني الموضح هنا. لتحقيق ذلك ، قم بوزن الكميات المناسبة من PEG و dex وفقا للرسم البياني واخلطهما في الوسائط عن طريق هزها برفق حتى يذوب كلا البوليمرين تماما. قد يستغرق ذلك عدة ساعات بعد إذابة البوليمرات بالكامل.

يجب أن يكون الحل غائما. تأكد من فصل الطور عن طريق الطرد المركزي للعينات عند 1000 جي ثانية لمدة خمس دقائق. ستكون المرحلة السفلية الأكثر كثافة غنية ب dex.

ستكون المرحلة العليا غنية بالوتد. بعد ذلك ، أضف ببطء 0.1 مل من الوسط الإضافي إلى الأنابيب وقم بدوامة العينات لمدة 20 ثانية. ثم الطرد المركزي للعينات مرة أخرى للتحقق من فصل الطور.

يكون المحلول واضحا بعد إضافة كميات إضافية من الوسيط ، كرر هذه الخطوة مع إضافة 0.1 ملليلتر آخر من الخلط المتوسط والطرد المركزي للعينات حتى يصبح المحلول واضحا ولم يعد ينفصل الطور. يشير هذا إلى أنه تم الوصول إلى عتبة النقطة الحرجة لهذا الخليط المحدد. سجل الوزن النهائي لكل أنبوب في هذه المرحلة.

أخيرا ، حدد النسبة المئوية للوزن لكل وزن للبوليمرين عند نقطة فصل الوجه. ارسم منحنى عقدة الحاوية ، مع وضع النسبة المئوية للوزن لكل ربط وزن على المحور y والنسبة المئوية للوزن لكل طوابق وزن على المحور X. هذا المنحنى هو تركيزات العتبة لفصل الوجه بين PEG و dex في هذا الوسط.

لبدء استبعاد الزخرفة للخلايا ، قم بإعداد حلول منفصلة من PEG و dex عند ضعف قيم النقاط الحرجة ، كما تحددها عتبة عقدة السلة. بالنسبة لهذه التجارب ، تمت إضافة 5٪ من الوزن لكل وزن PEG و 12.8٪ وزن لكل وزن إلى DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية. يتم وضع الأنابيب على كرسي هزاز للسماح لها بالذوبان تماما.

بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا المراد استخدامها في استبعاد الزخرفة لهذه التجربة ، يتم تجميع خلايا hela عند التقاء 80٪ باستخدام 0.5٪ tripsin لمدة ثلاث دقائق. بمجرد الحصاد ، احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي ثم قم بتخمير الخلايا وإعادة تعليقها عند 375 ، 000 خلية لكل مليلتر في الوسط مع إضافة 5٪ PEG. سينتج عن هذا التركيز عينات ستصبح ملتصقة في اليوم التالي.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة صغيرة ، قم بتوزيع 0.5 ميكرولتر قطرات من محلول سطح السفينة بنسبة 12.8٪ على صفيحة بئر جافة 96 لزخرفة الاستبعاد. يمكن السماح لقطرات Dex بالجفاف في ظروف معقمة لاستخدامها لاحقا. ثم قم بتوزيع 200 ميكرولتر من معلق خلية PEG hela في البئر ببطء.

لتغطية قطرات D ، من المهم أولا تغطية قطرة D بمحلول PEG قبل ملء المناطق المحيطة لأن هذا يمنعها من تعطيل القطرة عندما تنتشر عبر البئر. بمجرد أن يتم تزيين جميع الآبار وبذرها بعناية ، ضع لوحة زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة. تأكد من عدم إمالة الطبق أثناء المناولة ووضعه على رف حاضنة مستو لتجنب تعطيل الأنماط بعد السماح للخلايا بالالتصاق لمدة 12 ساعة.

قم بإزالة محلول PEG واغسله ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من وسط الثقافة لإزالة أي بوليمرات متبقية. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج وأعد الطبق إلى الحاضنة. مراقبة الثقافات بشكل دوري لمراقبة تكاثر الخلايا والهجرة إلى مناطق الاستبعاد لبدء نقوش الجزر.

تحضير محاليل بوزن 5٪ لكل وزن PEG و 12.8٪ وزن لكل طوابق وزن في وسط زراعة الخلايا. قم أيضا بحصاد خلايا هيلا لاستخدامها في زخرفة الجزيرة ومرة أخرى ، حدد العدد الإجمالي للخلايا المتاحة باستخدام مقياس الخلوي الدموي. الحبيبات التالية وإعادة الظهر.

قم بتدوير الخلايا بمعدل 5 ملايين خلية لكل مليلتر في المتوسط. مع استمرار 12.8٪ dex ، قد تكون هناك حاجة إلى تركيز أعلى من الخلايا للوصول إلى التقاء في غضون 24 ساعة إذا لم تلتصق الخلايا وكذلك خلايا الكعب. بعد ذلك ، قم بإدخال 200 ميكرولتر من محلول PEG في كل بئر من لوح 96 بئر.

ثم أضف ببطء قطرة 0.5 ميكرولتر من تعليق خلية السطح في كل بئر يحتوي على محلول PEG. سوف تغرق القطرات في القاع وتلامس سطح الثقافة. ثم انقل اللوحة بعناية إلى الحاضنة ، مع الحرص على عدم إمالة الطبق في أي وقت ، مما قد يعطل الأنماط بعد 12 ساعة.

قم بإزالة محلول PEG واغسله ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج وأعد الطبق إلى الحاضنة. مراقبة الثقافات بشكل دوري لمراقبة تكاثر الخلايا وهجرتها إلى الخارج من الجزر.

ابدأ في الزخرفة المشتركة عن طريق إعداد محاليل بنسبة 5٪ من الوزن لكل وزن PEG و 12.8٪ وزن لكل وزن في DMEM مع 10٪ FPS و 1٪ تنمو المضادات الحيوية أيضا في نوعي الخلايا لاستخدامهما في الاستبعاد ونقوش الجزيرة بحيث يقتربان من التقاء. في الوقت نفسه هنا ، سنستخدم Hep G اثنين C3 وجزر خلايا الكبد مع المعاهد الوطنية للصحة ثلاثة T ثلاثة خلايا ليفية تحيط بها. ثم احصد نوعي الخلايا وقم بحسابهما بشكل منفصل باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

يمكن تمييز هذين النوعين من الخلايا بسهولة باستخدام حبيبات الفحص المجهري الساطع ، وخلايا الكبد Hep G اثنان C3 A لتزيين الجزيرة وإنفاق النسخ في 12.8٪ من الطوابق. ثم بيليه الخلايا الليفية للاستبعاد والزخرفة وتعليق التثبيت في 5٪ peg. بعد ذلك ، قم بتوزيع 0.5 ميكرولتر قطرات من تعليق الخلية D على لوحة بئر جافة سعة 96 وقم بتغطية قطرات dex برفق مع 200 ميكرولتر من تعليق خلية التثب.

ثم انقل اللوحة إلى حاضنة بعد 12 ساعة. قم بإزالة الوسائط واشطفها ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج وأعد الطبق إلى الحاضنة.

أخيرا ، يمكن استخدام كثافة تلطيخ الألبومين في الثقافات المشتركة لتقييم الآثار المفيدة للثقافة المشتركة للأرومات الليفية. يتم وصف تركيزات البوليمر المطلوبة لتشكيل مجموعة متنوعة من الأنظمة المائية ثنائية الطور هنا بواسطة منحنيات عقدية الحاوية بتركيزات فوق منحنى عقدة الصندوق. يشكل النظام مرحلتين أسفل منحنى عقدة الصندوق.

الحل عبارة عن أنظمة شفافة أحادية الطور ثنائية الطور مرتين على الأقل. تركيزات تلك الموجودة على المنحنى الثنائي كافية للاستخدام في الأنظمة المائية ثنائية الطور الموصوفة في هذا الفيديو. المثال الأول لاستخدامها هو نمط الاستبعاد حيث يمكن ترك مناطق صغيرة خالية من الخلايا.

يخلق زخرفة الجزيرة العكس تماما من نمط الاستبعاد حيث يمكن الجلوس في مناطق صغيرة مع الخلايا. يمكن استخدام الجمع بين هذين الإجراءين لتشكيل ثقافة مشتركة فريدة حيث يمكن أن تكون جزيرة من الخلايا محاطة بنوع آخر من الخلايا كما هو موضح هنا. سوف تتكاثر خلايا Hela المطلية باستخدام نمط الاستبعاد وتهاجر لملء الفراغ.

بمرور الوقت. يمكن مراقبة حجم الفراغ لتوفير رؤى قيمة حول هجرة الخلايا ونموها في ظل ظروف مختلفة. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام زخرفة الجزيرة لقياس نمو الخلايا.

ينتج عن الجمع بين نمط الجزيرة والاستبعاد مناطق محددة جيدا للثقافة المشتركة. تظهر هنا جزر من خلايا الكبد محاطة بخلايا الخلايا الليفية. تم العثور على هذه المستعمرات للحفاظ على تنظيمها لمدة أربعة أيام على الأقل في الثقافة.

باستخدام هذا النظام ، يمكن زراعة جزر متعددة من الخلايا على نفس اللوحة. عندما تزرع كجزر وحدها ، أنتجت خلايا الكبد ألبومين أقل قليلا مما كانت عليه عندما نمت في زراعة مشتركة مع الخلايا الليفية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام تركيزات البوليمرات بضعف التركيز الحرج لتشكيل محاليل ثنائية الطور.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صياغة نظام مائي ثنائي الطور واستخدامه لنمط الخلايا وتحديد الأشكال الهندسية.