Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد بكتيريا من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوسومي لمدة 16 ثانية باستخدام منهجية تسلسل البايرو. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضخيم الحمض النووي المستهدف أولا من خلال تفاعل متسلسل للبوليميراز باستخدام برايمر بيوتينيل. ثم يتم تثبيت أمبليكون البيوتينيل باستخدام حبات الأفير المطلية بالستربتافيدين وتنقيته باستخدام مخازن الغسيل.

بعد ذلك ، يتم تغيير طبيعة الamplicon و 16 ثانية من بادئات التسلسل الريبوزومي هي ELL للخيوط المفردة للحمض النووي. الهدف من هذه الخطوة هو تحضير الحمض النووي للتسلسل. أخيرا ، يحدث تفاعل تسلسل الحمض النووي عن طريق تسلسل pyro ، وهي طريقة سريعة ودقيقة لتسلسل الأحماض النووية بناء على مبدأ التسلسل عن طريق التوليف.

يتم استخدام الأليكون الحيوي كقالب بواسطة بوليميراز الحمض النووي لدمج DN TPS قاعدة واحدة في كل مرة تؤدي إلى توليد البيروفوسفات. يقوم TP Sul Urease بتحويل البيروفوسفات بشكل متناسب إلى A-T-P-A-T-P يحفز التحويل بوساطة لوسيفيراز من لوسيفر إلى لوسيفر ، مما يولد ضوءا يتناسب مع كمية TP. يتم تسجيل الضوء كذروة على أثر بايرو ويشير إلى دمج النيوكليوتيدات. يتم تحلل DN NTPs غير المدمجة بواسطة apras قبل إضافة DNTP التالي لمواصلة التوليف.

الإشارة الكيميائية المسجلة على الرسم البياني بتحديد تسلسل الحمض النووي. النتائج التي تم الحصول عليها هي تسلسل SDNA الريبوسومي 16 ، والتي تستخدم لتحديد البكتيريا بالمقارنة مع قاعدة بيانات الحمض النووي الريبوسومي المرجعية. تسلسل Pyro هو تقنية متعددة الاستخدامات تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي ويمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية وتمييز السلالات البكتيرية واكتشاف الطفرات الجينية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات.

في هذا الفيديو ، سيتم عرض إجراء توليد الميكروبات البكتيرية Amplicon pyro تسلسل وتحليل تسلسل الحمض النووي لبدء إجراء تضخيم القالب ، قم بإذابة جميع المحاليل المطلوبة واخلط كل منها جيدا. يمكن القيام بكل الأعمال في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لهذا الجدول.

لاحظ أن تركيز كلوريد المغنيسيوم النهائي البالغ 1.5 ملليمولار سيوفر نتائج مرضية في معظم الحالات. ومع ذلك ، إذا كان هناك حاجة إلى تركيز أعلى من المغنيسيوم يصل إلى 3.5 ميكرولتر من 25 مللي مولار ، فيمكن إضافة كلوريد المغنيسيوم إلى التفاعل. يجب أن يكون التمهيدي واحدا بيوتينيل في نهايته الأولية الخمسة ، ويوصى بتنقية البرايمر HPLC جيدا.

امزج خليط التفاعل عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل ، ثم قم بتوزيع الأحجام المناسبة في أنابيب PCR. بعد ذلك ، أضف قالب الحمض النووي إلى كل أنبوب PCR. يوصى باستخدام 10 نانوجرام من الحمض النووي الجيني لكل تفاعل.

ضع أنابيب PCR في جهاز تدوير وابدأ برنامج ركوب الدراجات هذا قبل عمل المزيج الرئيسي. قم بتدوير زجاجة الخرز المصلي العقدي والمغلف لضمان تعليق متجانس. قم بعمل مزيج رئيسي وفقا لمخطط التدفق هذا.

الجمع بين الخرز ، ومخزن مؤقت ملزم ، ومياه عالية النقاء في أنبوب طرد مركزي صغير. اعتمادا على حجم منتج PCR المستخدم ، يتم توزيع 60 إلى 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة PCR بحيث يكون الحجم الإجمالي 80 ميكرولتر لكل بئر. أضف خمسة إلى 20 ميكرولترا من منتج PCR البيوتينيل إلى كل بئر.

يجب أن يكون حجم البئر الآن 80 ميكرولترا. أغلق الآبار بأغطية شريطية وحرك لوحة PCR عند 1 ، 400 دورة في الدقيقة لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام شاكر مداري. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تخفيف بادئات التسلسل إلى 0.3 ميكرومولار مع عازلة راكعة وتوزيع 25 ميكرولترا في كل بئر من لوحة التفاعل.

ضع اللوحة على محطة عمل التفريغ. املأ أحواض محطة العمل وفقا لهذا الرسم التخطيطي. 50 مل من 70٪ الإيثانول في الحوض الواحد 40 مل من محلول التمسخ في حوض اثنين 50 مل من محلول الغسيل في الحوض الصغير ثلاثة 50 مل من الماء عالي النقاء في الحوض الصغير أربعة و 70 مل من المياه عالية النقاء في الحوض الخامس.

قم بتشغيل مضخة التفريغ وتأكد من ضبط المفتاح الموجود على أداة التفريغ على تشغيل شطف مجسات المرشح بماء عالي النقاء. في الحوض الخامس ، ضع لوحة PCR مع الخرز على محطة العمل مع التأكد من أن كل من PCR ولوحات التفاعل في نفس الاتجاه. اخفض أداة التفريغ في آبار لوحة PCR.

لمدة 20 ثانية أو حتى يتم شفط كل الحجم ، سيتم التقاط الخرزات بواسطة أداة التفريغ مع استمرار الفراغ. اغسل الأداة بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 20 ثانية أو حتى يتم شفط كل الحجم. بعد ذلك ، اغسل الأداة بمحلول التمسخ لمدة 20 ثانية أو حتى يتم شفط كل الحجم.

بعد ذلك ، اغسل الأداة بمخزن الغسيل المؤقت لمدة 20 ثانية أو حتى يتم شفط كل الحجم مع استمرار تشغيل المكنسة الكهربائية. ارفع أداة التفريغ إلى ما بعد 90 درجة رأسيا لمدة خمس ثوان للسماح لكل السائل بالتصريف من أداة التفريغ. الآن قم بإيقاف تشغيل المضخة وقم بمحاذاة أداة التفريغ بثلاثة لوحات تفاعل.

اخفض أداة التفريغ في الآبار. ثم رج العبوة برفق من جانب إلى آخر لمدة 10 ثوان تقريبا لتحرير الخرزات في الآبار التي تحتوي على برايمر التسلسل. ضع أداة التفريغ في حوض الماء للتنظيف لتنظيف التمهيدي التسلسل إلى الحمض النووي.

ضع لوحة التفاعل في حامل طبق دافئ. سخني الطبق على حرارة 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أخرجي الطبق من الحامل وضعيه على المنضدة لتبريده في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق تشغيل الجهاز باستخدام مفتاح الطاقة الموجود أعلى سلك الطاقة لتحديد وحدات التخزين المطلوبة. قم بإعداد ملف تشغيل في برنامج الأداة وضمن قائمة الأدوات، حدد معلومات التشغيل المسبق. املأ خرطوشة وفقا للإرشادات الواردة في صفحة معلومات التشغيل المسبق.

ضع طرف الماصة في زاوية كل بئر إلى أقصى حد ممكن، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء. افتح بوابة الخرطوشة وأدخل الخرطوشة بحيث يكون الملصق متجها للأمام. تأكد من إدخال الخرطوشة بشكل صحيح وأغلق البوابة.

افتح إطار تثبيت اللوحة وضع لوحة التفاعل داخل الجهاز. أغلق إطار تثبيت اللوحة وغطاء الجهاز. أدخل محرك أقراص USB مع ملفات التشغيل التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج الجهاز في منفذ USB في الجزء الأمامي من مكبس العداد.

حسنا ، لرؤية قائمة ملفات التشغيل المطلوبة. استخدم أسهم التمرير لتحديد ملف التشغيل المطلوب واضغط على تحديد. عند الوصول إلى جميع مستويات الضغط ودرجة الحرارة المحددة مسبقا ، ستبدأ الأداة في توزيع الكواشف أثناء التشغيل.

تعرض شاشة العدادات pyro للبئر المحدد في الوقت الفعلي. استخدم أسهم التمرير لعرض بايروس الآبار الأخرى. عندما تؤكد الأداة أن التشغيل قد انتهى وتم حفظ ملف التشغيل على محرك أقراص USB ، اضغط على إغلاق.

قم بإزالة محرك أقراص USB. يتم عرض نتائج تشغيل تسلسل pyro النموذجي هنا. تم تصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأمامية والعكسية للمناطق المحفوظة من قالب الحمض النووي ، وهو التسلسل الريبوسومي 16 ثانية.

في هذا المثال ، يتم وضع التمهيدي للتسلسل مباشرة في المنبع من تسلسل الحمض النووي شديد التغير المميز بشكل جيد داخل الamplicon الموضح باللون الأزرق. يسمح هذا التسلسل المتغير للغاية بتحديد البكتيريا لعدد كبير من الأنواع البكتيرية باستخدام التمهيدي التسلسل المحفوظ كمراقبة داخلية للجودة ، ويمكن التحقق من تسلسل الحمض النووي الذي يضع المنطقة المتغيرة للتأكد من تحليل منطقة الحمض النووي الصحيحة. يسمح برنامج تسلسل pyro بمقارنة ومحاذاة التسلسل المتولد مع قاعدة بيانات داخلية للتسلسلات الريبوسومية البكتيرية لتحديد البكتيريا.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل التسلسل لتحديد الطفرات التي تمنح مقاومة للأدوية بالمضادات الحيوية. على سبيل المثال ، يكشف تحليل الطفرات في الجينات الريبوزومية 23 ثانية من هيليكوباكتر بيلوري عن نمطين من الطفرات ، GAA أو GA اللذين يمنحان مقاومة للمضادات الحيوية. تسلسل Pyro هو تقنية متعددة الاستخدامات تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي.

تشمل مزايا تسلسل بايرو من تطبيقات علم الأحياء الدقيقة الفحص السريع والموثوق عالي الإنتاجية والتحديد الدقيق للميكروبات وطفرات الجينوم الميكروبي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لمنهجية تسلسل pyro تحليل التنوع الجيني الكامل لمقاومة الأدوية المضادة للميكروبات ، بما في ذلك كتابة طفرات نقطة SNPs ، والإدخالات والحذف ، بالإضافة إلى القياس الكمي لنسخ الجينات المتعددة التي قد تحدث في بعض أنماط مقاومة مضادات الميكروبات. شكرا لك على مشاهدة هذا الفيديو ونتمنى لك التماثل في تجارب التسلسل الخاصة بك.