الايض غير مستهدفة من مصادر بيولوجية عن طريق Ultraperformance اللوني السائل عالية الدقة الطيف الكتلي (UPLC-HRMS)

الهدف العام من التجربة التالية هو مقارنة لقطات من الملامح الأيضية لمجموعات مختلفة من العينات البيولوجية. يتم تحقيق ذلك باستخدام استخراج سائل سائل لفصل الجزيئات العضوية والقطبية. كخطوة ثانية ، يتم فصل الجزيئات بشكل أكبر عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي عالي الدقة ، والذي يوفر وقت الاحتفاظ ونسبة الكتلة إلى الشحن وبيانات الكثافة لمزيد من التحليل.

بعد ذلك ، تتم محاذاة عمليات تشغيل الكروماتوغرافيا السائلة ويتم اكتشاف الميزات وتحديدها كميا وفرزها. من أجل تحديد السمات الوفيرة تفاضلية بين المجموعات. تظهر النتائج الاختلافات في الميزات عبر ظروف العلاج بناء على الوفرة التفاضلية للتحليلات كما تم اكتشافها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة ، وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة.

على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي ، إلا أنها يمكن أن توفر أيضا نظرة ثاقبة لاكتشاف المؤشرات الحيوية أو التمثيل الغذائي الحيوي زينو. بالنسبة للخطوط الملتصقة ، أضف 1.5 مل من الوسائط إلى الخلايا في صفيحة 10 سم. ضع الطبق على الثلج واكشطه برفق لرفع الخلايا.

انقل 1.5 مل من تعليق الخلية المرفوعة إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي سعة 10 مليلتر مسمى مسبقا. بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من اثنين إلى واحد من الميثانول الكلوروفورم إلى كل من الأنابيب الزجاجية سعة 10 ملليلتر التي تحتوي على العينات. رج العينات على سرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة بعد الاهتزاز ، قم بالطرد المركزي للعينات بإعداد تباطؤ تسارع منخفض عند 1 ، 935 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لفصل المراحل تماما باستخدام ماصة المراعي الطويلة الجذعية.

انقل الطبقة العضوية إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد سعة 10 ملليلتر مسمى مسبقا. بعد ذلك ، انقل الطبقة المائية إلى أنبوب بلاستيكي نظيف سعة ملليلتر. في هذه المرحلة ، تبخر العينات العضوية والمائية تحت غاز النيتروجين.

أعد تكوين العينات المجففة في 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول البداية لطريقة UPLC المطلوبة. قم بسحب العينة برفق لأعلى ولأسفل للمساعدة في إذابة التحليلات. ثم انقل كل عينة إلى مرشح أنبوب نايلون 0.22 ميكرون وقم بتدوير ما يصل إلى 14 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق تقريبا حتى تمر العينة بالكامل عبر الفلتر.

افحص العينة للتأكد من عدم وجود رواسب مرئية متبقية في العينة. انقل المادة الطافية للعينة المفلترة إلى قارورة UPLC مسبقة التصنيف مع غطاء إدخال القارورة. ثم قم بنقره لإزالة أي فقاعات من أسفل قارورة العينة.

ضع العينة في جهاز أخذ عينات السيارات المبردة. الآن قم بإنشاء تشغيل للعينة العضوية باستخدام برنامج التحكم في الكروماتوجراف السائل. بعد ذلك، قم بإنشاء تشغيل للعينة العضوية استنادا إلى شروط UPLC المحسنة.

استخدم شروط UPLC المحسنة لإنشاء طريقة للطور المائي أيضا. إذا كانت مجموعة معروفة من التحليلات المستهدفة ذات أهمية كبيرة ، فقم بتحسين ظروف UPLC باستخدام التناظرية ذات العلامات الثقيلة لهذه المركبات وإنشاء طريقة. باستخدام هذه الشروط ، اسمح ل UPLC بالتوازن بشكل كاف.

يجب أن يشمل ذلك تحضيرا كاملا للمذيبات قبل إرفاق عمود واتباع توجيهات الشركة المصنعة لحجم التوازن لعمود جديد ، احتفظ بسجل لضغوط البداية الخلفية للمساعدة في تشخيص المشكلات المستقبلية باستخدام برنامج التحكم لمطياف الكتلة عالي الدقة. قم بإنشاء طريقة الوضع الإيجابي. ثم باستخدام نفس الشروط ، قم بإنشاء طريقة الوضع السلبي.

تنظيف ومعايرة الجهاز. قم بإنشاء رش ثابت في مقياس الطيف واترك الوقت لحل المعايرة لتبدد بشكل كاف من المصدر والبصريات. يجب أن يعطي الاستقرار المقبول للرش انحرافا معياريا نسبيا من ثلاثة إلى 5٪ من الشدة على مدى 100 عملية مسح على الأقل مع حقن محلول المعايرة بنفس معدل التدفق مثل طريقة lc المستخدمة.

باستخدام مولد أرقام عشوائي ومفتاح ، قم بإعداد العينات بطريقة عشوائية لتجنب أي تأثيرات دفعية يقدمها التحليل. قم بإعداد التسلسل لجميع العينات. اضبط حجم الحقن المناسب وقم بتشغيل فراغ قبل العينة الأولى.

في حالة الاشتباه في تأثيرات الترحيل أو المصفوفة بين العينات ، قم بتشغيل فراغات أو غسلات كافية ، وابدأ التسلسل وراقب بشكل دوري المشكلات بما في ذلك تقلبات الضغط أو فقدان شدة الإشارة عبر التشغيل. إذا تم اكتشاف مشاكل خطيرة ، فأوقف التشغيل. تنظيف ومعايرة الجهاز.

قم بإنشاء رش ثابت في مقياس الطيف واترك الوقت لحل المعايرة لتبدد بشكل كاف من المصدر والبصريات. قبل البدء في التحليل التفاضلي ، تحقق يدويا من إجمالي التيارات الأيونية أو انظر إلى الكروماتوغرامات المفلترة لأي مركب معروف في العينة. لضمان استنساخ عمليات التشغيل واستقرار الرش المائل UPLC المائل للحقن في جميع العينات ، قم بنقل ملفات بيانات RAW من مطياف الكتلة إلى القرص الصلب لمحطة العمل حيث يتم تثبيت الغربال

غربال مفتوح. ابدأ تجربة جديدة وقم بتحميل الملفات المناسبة في غربال. قم بتعيين مجموعات المقارنة وحدد ملفا مرجعيا واحدا للسماح ل SIE V بإنشاء معلمات التحليل.

اتبع التعليمات واضبط أي معلمات وفقا لمتطلبات أي تجربة فردية. قم بتحميل قائمة المقربة الصحيحة للوضع الإيجابي أو السلبي في المعلمات. بمجرد الانتهاء من التحليل ، تحقق من ملء قائمة الإطارات على الشاشة.

تأكد من أن محاذاة lc تتراكب أي قمم بارزة. إذا أظهر أي من عمليات تشغيل lc غير المحاذاة انحرافا كبيرا في قمم المعالم التاريخية. قد يشير هذا إلى وجود مشكلة في العينة.

ارسم البيانات حسب معامل التباين داخل مجموعة عينة مماثلة. قم بفرز القائمة بناء على السمات المطلوبة. بعد ذلك ، افحص كل ذروة لمحاذاة الذروة المناسبة عبر المجموعات.

الذروة ، الغوسي ، كثافة إشارة شكل الذروة ، النظائر وتعيين المقربة. تصدير البيانات حسب الرغبة لمزيد من التحليل أو لإنشاء قوائم جماعية مستهدفة للتأكيد و MS حتى نهاية التجارب. تم تحديد عدد كبير من الزيارات من خلال البرنامجين المستخدمين للنقاط الخضراء التفاضلية وهي ميزات أكثر وفرة في التحكم ، في حين أن النقاط الحمراء أكثر وفرة في العلاج.

يشير حجم النقطة الأكبر إلى زيادة حجم تغيير الطية بين المجموعات وتظهر شدة اللون انخفاض قيمة P مع زيادة تشبع اللون المصور. فيما يلي الكروماتوغرامات التي توضح وضع الأيونات الموجب للطور العضوي تظهر نافذة تحليل UPLC MS A إجمالي تيار الأيونات من S Civ 2.0. يتم عرض الكروماتوجرام الأيوني المستخرج للميزة التي تم تحديدها على أنها D paneth بواسطة XCMS في النافذة B.تعرض النافذة C الكروماتوجرام الأيوني المستخرج للميزة المحددة على أنها تعفن معروف من sve.

تعرض النافذة D الكروماتورسم الأيوني المستخرج للميزة المحددة على أنها تعفن معروف من sve الذي تم تطبيعه إلى إجمالي تيار الأيونات. تم تحديد ميزة وفيرة تفاضلية تم تخفيضها في المجموعة المعالجة المعروفة بالعفن مبدئيا على أنها d panadine من خلال البحث الدقيق في قاعدة البيانات الجماعية. تم تأكيد هوية التحليل باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي U-P-L-C-H-R.

تظهر هنا مقارنة بين الكروماتوغرامات وأطياف الكتلة للعينة والمركب النقي. لا تنس أن العمل مع الكلوروفورم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتباع الاحتياطات المناسبة مثل غطاء الدخان جيد التهوية.