A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار اختبار ربط الحمض النووي الكمي ، وهو أمر مفيد في فحص تفاعلات الحمض النووي للبروتين ، واكتشاف منظمات النسخ للتعبير الجيني وتحديد العوامل الجديدة المضادة للورم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير لوحة فحص مطلية بالستربتافيدين أولا بهدف الحمض النووي الحيوي المناسب. الخطوة الثانية هي إضافة بروتينات المستخلص النووي مع أو بدون مثبطات محتملة والسماح لها بالارتباط بهدف الحمض النووي.

بعد ذلك ، يتم الكشف عن عوامل النسخ المرتبطة بالأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية المقترنة ببيروكسيداز فجل الحصان. الخطوة الأخيرة هي إضافة ركيزة بيروكسيداز فجل الحصان إلى الآبار من أجل استنباط تطور اللون. في النهاية ، يتم قياس تطور اللون باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

بمرور الوقت ، سيشير مقدار تغير اللون إلى درجة ارتباط الحمض النووي وتأثير المثبطات المحتملة لربط الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الأخرى ، مثل مقايسة تحول الحركة الكهربية ، هي أنها مقايسة ربط مثبطات الحمض النووي الكمي. للبدء ، قم بإعداد عدد كاف من مزارع الخلايا التي تتكون من ثلاثة أضعاف على الأقل 10 إلى سبع خلايا لكل حالة تم اختبارها.

هنا ، يتم استخدام الخلايا البطانية لنخاع العظم البشري ، والتي تعبر عن بروتين Run X two. بمجرد أن تكون الخلايا 80٪ ملتقية. عالج الخلايا ب 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر ، بدون كونازول لإيقاف نمو الخلايا عند حدود دورة الخلية G two M.

سيؤدي ذلك إلى استقرار البروتين X Two وإنتاج أقصى ارتباط للحمض النووي بعد 16 ساعة. قم بتقطيع الخلايا وعزل البروتين وفقا للتوجيهات الواردة في بروتوكول النص المصاحب. بمجرد عزل البروتين ، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار BCA القياسي.

ثم قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في 10 ميكرولتر بتركيزات تتراوح بين ملليغرام وخمسة ملليغرام لكل ملليلتر. قم بإصلاح لوح 96 بئر بمحلول 0.1 مولار من كربونات الصوديوم بإضافة 300 ميكرولتر من الخليط لكل من. حسنا ، قم بالتحضير جيدا بما يكفي بحيث يتم تشغيل كل عينة في ثلاث نسخ.

احتضان اللوحة لمدة ساعتين على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من البكتيريا العقدية وقم بغسل المخزن المؤقت واحتضانه ب 100 ميكرولتر من البيوتين المسمى قليل النوكليوتيدات المزدوجة التي تقطعت بهم السبل عند 1.25 نانومول لكل بئر لمدة ساعتين أثناء التأرجح. بعد ذلك ، اغسل الأطباق ثلاث مرات إضافية باستخدام المخزن المؤقت للغسيل العقدي.

ثم أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من المزيج الرئيسي الذي يحتوي على بروتينات ربط الحمض النووي العازلة XDNA بمعدل ثلاثة إلى تسعة ميكروغرام لكل بئر وبولي DIGC عند ميكروغرام واحد لكل بئر. ثم أضف المزيج الرئيسي الذي يحتوي على أي مثبط محتمل مثل فيتامين د ثلاثة أو التخفيف المناسب للتحكم في المذيبات ، مثل الإيثانول إلى الآبار الخاصة بهم. ثم قم بتغطية اللوحة وضعها على منصة هزازة عند أربع درجات مئوية طوال الليل بعد الحضانة بالمستخلصات النووية.

اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام البكتيريا العقدية وغسل المخزن المؤقت. ثم أضف 90 ميكرولترا لكل بئر من تشغيل X جسمان مضادان أحادي النسيلة محددان مخففان إلى 0.2 نانوغرام لكل ميكرولتر وبكتيريا مشتقة وغسيل. قم بتغطية الطبق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة ساعة.

ثم اشطف الآبار مرة أخرى باستخدام البكتيريا العقدية وغسل المخزن المؤقت وأضف 90 ميكرولترا لكل بئر من خليط الجسم المضاد الثانوي الذي يحتوي على خمسة نانوجرام لكل ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق المترافق المنقى HRP المخفف في البكتيريا. AVID ومخزن غسيل. احتضان الجسم المضاد الثانوي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة.

ثم اغسلها ست مرات باستخدام 300 ميكرولتر لكل بئر من Strp وغسل المخزن المؤقت. بعد ذلك ، قم بتطوير النتائج عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من ركيزة رباعي إيثيل بينادين إلى كل بئر مباشرة من زجاجة المخزون للمراقبة المستمرة للعينات. ضع العينات في مقياس الطيف الضوئي وقم بقياس الامتصاص عند 635 نانومتر بشكل متواصل.

لقياس لمرة واحدة ، احتضان العينات لمدة 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. خلال هذا الوقت ، يجب أن تتغير الآبار من درجات صافية إلى درجات متفاوتة من اللون الأزرق. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولترا من حمض الكبريتيك لكل منهما.

حسنا ، قم بقياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة 96 بئر. الرسم البياني الموضح هنا هو مثال على المراقبة المستمرة لتأثير فيتامين د ثلاثة النشط بيولوجيا على ربط تشغيل X 2D NA. كان للتركيزات التي تم اختبارها تأثير ضئيل على ربط تشغيل X 2D NA.

على الرغم من أن فيتامين (د) الآخر، فقد ثبت أن ثلاثة مركبات لها تأثيرات كبيرة. تم تحديد المركب 5 2 2 1 9 7 5 الذي تم اختباره هنا باستخدام تصميم الأدوية بمساعدة الكمبيوتر. عند الاختبار ، أظهر المركب تثبيطا يعتمد على الجرعة لربط rux two من نانومولار واحد إلى 100 ميكرومولار 50٪ من ارتباط renx 2D NA كان من الممكن تثبيطه باستخدام 0.01 ميكرومولار فقط من المركب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء مقايسة ربط الحمض النووي واختبار المثبطات المحتملة لربط الحمض النووي.