A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح مقايسة كمية لربط الحمض النووي DNA، والتي تُعد مفيدة في فحص التفاعلات بين البروتين والحمض النووي DNA، واكتشاف المنظمات النسخية للتعبير الجيني، وتحديد عوامل جديدة مضادة للأورام. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير طبق مقايسة مغطى بالستربتافيدين مع هدف DNA مبيوتين (BIOTINYLATED DNA) مناسب أولاً. وتتمثل الخطوة الثانية في إضافة بروتينات المستخلص النووي مع أو بدون مثبطات محتملة، والسماح لها بالارتباط بهدف DNA.

بعد ذلك، يتم الكشف عن عوامل النسخ المرتبطة باستخدام أجسام مضادة أولية وأجسام مضادة ثانوية مقترنة بإنزيم horse radish peroxidase. وتتمثل الخطوة النهائية في إضافة ركيزة horse radish peroxidase إلى الآبار من أجل تحفيز ظهور اللون. وفي الختام، يتم قياس تطور اللون باستخدام spectrophotometer.

بمرور الوقت، سيشير مقدار التغير في اللون إلى درجة ارتباط DNA وتأثير المثبطات المحتملة لارتباط DNA. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالتقنيات الأخرى، مثل مقايسة إزاحة الحركية الكهربائية، في كونها مقايسة كمية لارتباط مثبط DNA. وللبدء، قم بتجهيز عدد كافٍ من المزارع الخلوية التي تتكون من 3 × 10⁷ خلية على الأقل لكل حالة من الحالات المختبرة.

يتم هنا استخدام خلايا بطانية من نخاع العظم البشري، والتي تعبر عن بروتين run X two. وبمجرد وصول الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 80%، تُعالج الخلايا بـ 0.2 micrograms per milliliter من nocodazole لوقف نمو الخلايا عند حدود مرحلة G two M من الدورة الخلوية.

سيؤدي ذلك إلى تثبيت بروتين run X two وتحقيق أقصى قدر من الارتباط بالـ DNA بعد 16 ساعة. قم بتحليل الخلايا وعزل البروتين وفقاً للإرشادات الواردة في البروتوكول النصي المرفق. وبمجرد عزل البروتين، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA القياسية.

بعد ذلك، تُخزن العينات عند درجة حرارة -80 °C في حصص قدرها 10 µL بتركيزات تتراوح بين 2 و5 mg/mL. يتم تثبيت لوحة ذات 96 بئراً باستخدام محلول كربونات الصوديوم بتركيز 0.1 M عن طريق إضافة 300 µL من الخليط لكل بئر. يتم تجهيز عدد كافٍ من الآبار بحيث يتم تشغيل كل عينة في ثلاث مكررات.

قم بحضن الطبق لمدة ساعتين على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام 300 µL من محلول غسيل strep avid، ثم قم بالتحضين مع 100 µL من قليلات النوكليوتيد مزدوجة السلسلة الملحقة بالبيوتين بتركيز 1.25 nanomoles لكل بئر لمدة ساعتين مع الهز. وأخيرًا، اغسل الأطباق ثلاث مرات إضافية باستخدام محلول غسيل strep din.

ثم أضف 100 µL لكل بئر من المزيج الرئيسي (master mix) الذي يحتوي على 1X DNA binding buffer وبروتينات ربط DNA بتركيز يتراوح من 3 إلى 9 µg لكل بئر و poly DIGC بتركيز 1 µg لكل بئر. بعد ذلك، أضف المزيج الرئيسي الذي يحتوي على أي مثبط محتمل مثل vitamin D3 أو التخفيف المناسب من ضابط المذيب، مثل ethanol، إلى الآبار المخصصة لها. ثم غطِّ الطبق وضعه على منصة هزازة (rocking platform) عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل بعد التحضين مع المستخلصات النووية.

اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل strep avid. بعد ذلك، أضف 90 µL لكل بئر من جسم مضاد أحادي النسيلة محدد لـ run X two مخفف إلى 0.2 ng/µL في محلول غسيل strep avid. غطِّ الطبق واحضنه في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، اشطف الآبار مرة أخرى باستخدام محلول strep avid ومحلول الغسيل، وأضف 90 µL في كل بئر من خليط الأجسام المضادة الثانوية الذي يحتوي على 5 ng/µL من الجسم المضاد المرتبط بـ HRP والمنقى بالألفة لـ fab والمخفف في محلول strep. AVID ومحلول الغسيل. حضّن الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة.

بعد ذلك، اغسلها ست مرات باستخدام 300 µL لكل بئر من محلول Strp وwash buffer. بعد ذلك، قم بتطوير النتائج بإضافة 50 µL من ركيزة tetraethyl benadine إلى كل بئر مباشرة من زجاجة المخزون للمراقبة المستمرة للعينات. ضع العينات في جهاز المطياف الضوئي وقم بقياس الامتصاصية عند 635 nm بشكل مستمر.

لإجراء قياس لمرة واحدة، قم بتحضين العينات لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. خلال هذه الفترة، يجب أن يتغير لون الآبار من الشفاف إلى درجات متفاوتة من اللون الأزرق. أوقف التفاعل بإضافة 50 µL من حمض الكبريتيك إلى كل بئر.

بعد ذلك، قم بقياس الامتصاصية لكل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفائح 96 بئر. يمثل الرسم البياني الموضح هنا مثالاً للمراقبة المستمرة لتأثير فيتامين D الثلاثة النشط بيولوجياً على ارتباط run X 2D NA. وكان للتركيزات المختبرة تأثير ضئيل على ارتباط run X 2D NA.

على الرغم من أن مركبات أخرى من فيتامين D3 أظهرت تأثيرات ملحوظة، إلا أن المركب 5 2 2 1 9 7 5 الذي تم اختباره هنا تم تحديده باستخدام تصميم الأدوية بمساعدة الحاسوب. وعند الاختبار، أظهر المركب تثبيطاً يعتمد على الجرعة لارتباط rux two في نطاق يتراوح من 1 nanomolar إلى 100 micromolar، حيث أمكن تثبيط 50% من ارتباط renx 2D NA باستخدام 0.01 micromolar فقط من المركب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء مقايسة ارتباط الحمض النووي DNA واختبار المثبطات المحتملة لهذا الارتباط.