ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد معدلات استئصال ثمانية OXO Guine وإطلاق المنتج لثمانية OXO Guine ، جليكوسيلات الحمض النووي باستخدام تقنيات الحركية السريعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس المسار الزمني للحالة المستقرة أولا بتركيز إنزيم منخفض لتحديد ما إذا كانت المرحلة السريعة تحدث أثناء الدوران الأول. إذا كان الدوران الأول سريعا ، فإن المسار الزمني للحالة المستقرة لا يستنبط إلى الصفر ، ولكنه يعكس بدلا من ذلك تركيز الإنزيم النشط كخطوة ثانية.

يمكن قياس معدل تكوين المنتج أثناء الحالة المستقرة السابقة عن طريق تقنيات الخلط والتبريد السريع بتركيز إنزيم أعلى لمراقبة كمية كبيرة من المنتج أثناء الدوران الأول. بعد ذلك ، يمكن أيضا مراقبة الخطوة الكيميائية في ظل ظروف دوران فردية حيث تكون الركيزة مشبعة بالإنزيم. من أجل عزل الأحداث في الموقع النشط للإنزيم دون دورة تحفيزية ، تظهر النتائج أن إطلاق المنتج من الإنزيم يحد من المعدل أثناء الحالة المستقرة بناء على ملاحظة أن المسار الزمني لا يستنبط إلى منتج صفري في وقت الصفر.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصلاح شفاه الحمض النووي. يتضمن ذلك تأثير بنية الحمض النووي ، ودور بقايا الموقع النشطة ، وتأثير أيونات المعادن ، والبروتين الملحق للخلية على الكيمياء وإطلاق المنتج. أولا ، قم بإعداد ركيزة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل والتي تحتوي على ثمانية OXO G عن طريق خلط خمسة أولية من ستة عائلة تسمى قليل النوكليوتيدات مع خيطها التكميلي بنسبة واحد إلى 1.2 مولار في مخزن مؤقت راكع في أنبوب فوج دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

ضع الأنبوب في عوامة في الماء المغلي لمدة خمس دقائق. اترك الماء يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة قبل إزالة الأنبوب من العوامة. قم بإعداد ركيزة الحمض النووي ومحاليل OG G one بشكل منفصل في المخزن المؤقت للتفاعل في أنابيب fuge دقيقة سعة 1.5 ملليلتر على الجليد.

لاحظ أن تركيز الحمض النووي هو 400 نانو مولار والتركيز الظاهري ل Ogg one هو 30 أو 60 أو 90 أو 120 نانومولار كما هو محدد بواسطة اختبار بروتين برادفورد بعد إزالة أنابيب التفاعل من الجليد ، قم باحتضان كل محلول مسبقا عن طريق وضع الأنبوب في كتلة حرارية مثبتة على 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، ابدأ التفاعل عن طريق خلط كميات متساوية من ركيزة الحمض النووي ومحلول OG واحد لإعطاء تركيزات نهائية من 200 نانو مولار DNA و 15 أو 30 45 أو 60 نانومولار OG G واحد. قم بإزالة 10 ميكرولتر من الحصص في الفترات الزمنية المذكورة وإخماد التفاعل عن طريق الخلط مع ميكرولتر واحد من هيدروكسيد الصوديوم المولي كعنصر تحكم في الدورات الزمنية.

امزج 10 ميكرولترات من خليط التفاعل بدون إنزيم مع ميكرولتر واحد من هيدروكسيد الصوديوم المولاري. ضع عينات التفاعل في كتلة حرارية 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لشق موقع AP الناتج للمنتج. بعد التسخين ، أضف ميكرولتر واحد من حمض الهيدروكلوريك المولي لتحييد كل عينة.

بعد ذلك ، أضف 12 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل الهلام إلى كل عينة تفاعل ، ثم ضع الخليط في كتلة حرارية مثبتة على 95 درجة مئوية. بعد دقيقتين ، قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة وضعه على الثلج. قم بتحميل خمسة ميكرولترات من كل عينة على جل بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 15٪.

بمجرد تشغيل الجل ، قم بمسحه ضوئيا باستخدام جهاز تصوير يمكنه اكتشاف الحمض النووي المسمى بالفلورسنت وتصور الركيزة ونطاقات المنتج. بعد تصوير الجل ، حدد النطاقات إذا لوحظ انقسام في الخلفية بعد معالجة الركيزة بهيدروكسيد الصوديوم ، اطرح هذه الخلفية من الكمية المقاسة لكل منتج تفاعل. بعد ذلك ، ارسم كمية المنتج المتكونة في كل وقت تفاعل.

قم بتحليل البيانات الأولية باستخدام المعادلة التالية لتحديد العقدة وسعة الانفجار و VSS منحدر مرحلة الحالة المستقرة الخطية ارسم تقاطع Y بالنسبة لتركيز البروتين الكلي. توفير مقياس للجزء النشط من الإنزيم. استخدم ملاءمة خطية مع تقاطع صفري لتوفير عامل التصحيح لتحديد جزء الإنزيم النشط.

ثم ارسم الحالة المستقرة بالنسبة لتركيز الإنزيم النشط ، مما يوفر معدل ارتباط المنتج ثابتا في أنبوبين منفصلين من خمسة ملليلتر. قم بإعداد 400 ركيزة نانومولية للحمض النووي و 80 محلول نانومولار نشط في محلول تفاعل واحد كما هو موضح سابقا. قم بتوصيل حمام مائي دائري بأداة تدفق التبريد السريع واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اضبط معلمات الأداة وحدد حلقة رد الفعل المناسبة للنقاط الزمنية المطلوبة. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتفاعل و 142 محلول إخماد هيدروكسيد الصوديوم. في 10 مليلتر إغراء قفل المحاقن التي يمكن التخلص منها.

قم بتوصيل حقنة بها هيدروكسيد الصوديوم بمنافذ القيادة واضبط الصمامات على موضع التحميل. قم بتحميل خزانات محرك الأقراص بهيدروكسيد الصوديوم في المحقنة Q لإزالة فقاعات الهواء من المحقنة. اعمل الحل ذهابا وإيابا عدة مرات.

بعد ذلك ، قم بتوصيل المحاقن مع المخزن المؤقت للتفاعل بمنافذ محرك الأقراص وقم بتحميل المخزن المؤقت في المحاقن. B ، بنفس الطريقة مع جميع الصمامات في وضع النار ، قم بخفض محرك السائر حتى يلامس الجزء العلوي من المحاقن. مع وجود صمامات تحميل العينة في وضع التدفق ، قم بغسل حلقات العينة وحلقة التفاعل وخط الخروج بالماء والميثانول.

بعد ذلك ، جفف الحلقات وخط الخروج تماما عن طريق غسلها بالهواء. اصنع ثقبا في الجزء العلوي من أنبوب 1.5 ملليلتر. باستخدام إبرة قياس 16 ، قم بتوصيل الأنبوب بخط الخروج عبر الأنبوب لتجميع التفاعل المروي.

بعد ذلك ، قم بتعيين رد الفعل المطلوب. الوقت بالثواني باستخدام لوحة المفاتيح. بعد أن يتراجع محرك السائر ، ضع غطاسات المحقنة B مقابل منصة محرك السائر عن طريق إضافة عازلة مع المحاقن التي تستخدم لمرة واحدة متصلة بمنافذ القيادة.

املأ محاقن قفل إغراء واحدة مليلتر مع محاقن الحمض النووي ومحاليل ogg one على التوالي. مع وجود صمامات العينة في موضع الحمل ، قم بتوصيل المحاقن بركيزة الحمض النووي وحلول ogg واحدة لكل منفذ من منافذ تحميل العينة ثم املأ حلقات العينة بمجموعة المحاليل. تبدأ جميع صمامات تحميل الحقنة وصمامات تحميل العينة إلى موضع النار التفاعل بالضغط على مفتاح G.

بمجرد الضغط على مفتاح G ، يدفع محرك السائر الجزء العلوي من المحاقن لبدء التفاعل وإخماده. بعد إخماد 36 ميكرولترا من خليط التفاعل تلقائيا ب 86 ميكرولتر من 142 ملليمول. يجمع هيدروكسيد الصوديوم العينة من خط الخروج.

بمجرد اكتمال التفاعل ، اضبط صمامات تحميل المحقنة على موضع الحمل وصمامات تحميل العينة على موضع التدفق. اغسل حلقات العينة وحلقة التفاعل وخط الخروج بالماء والميثانول وجفف المناطق المتدفقة تماما. كرر الخطوات السابقة لكل نقطة زمنية.

لتحديد تصحيح الخلفية. قم بإجراء تجربة تحكم بدون إنزيم باستخدام أداة التبريد السريع. املأ حلقة عينة الحمض النووي بركيزة الحمض النووي ، ولكن احتفظ بحلقة عينة واحدة فارغة.

اضبط وقت رد الفعل. قم بإجراء المزيج والتبريد باستخدام نفس الظروف كما كان من قبل. اغسل حلقات العينة باثنين من هيدروكسيد الصوديوم المولي ، واثنين من ماء حمض الهيدروكلوريك المولي والميثانول ، ثم جفف الخطوط المغسولة.

بعد ضبط محرك السائر على الوضع المنزلي ، قم بتبديل صمامات تحميل المحقنة إلى موضع التحميل واغسل خزانات محرك الأقراص بالماء. بعد تسخين عينات التفاعل المروية ، افصل الركيزة والحمض النووي للمنتج عن طريق تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد بنسبة 15٪. ثم تصور وتحديد العصابات الموجودة على الجل كما هو موضح.

في السابق ، تناسب الدورات الزمنية لتكوين المنتج عن طريق تحليل الانحدار غير الخطي إلى المعادلة التالية مع شروط أسية وخطية صاعدة توفر ثابت معدل الدرجة الأولى K لاحظ سعة الانفجار والعقدة والمعدل الخطي VSS. لتجربة دورة وقت الدوران الفردي. قم بإعداد 100 ركيزة نانو مولار للحمض النووي و 500 محلول نشط نانو مولار في أنابيب منفصلة سعة 1.5 ملليلتر.

باستخدام الظروف الموصوفة سابقا ، قم بإعداد أداة تدفق التبريد السريع وإجراء التفاعل بنفس الطريقة وتجربة الدورة الزمنية للحالة المستقرة المسبقة. بمجرد تسخين العينات المروية وفصلها عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ، قم بتصور وتحديد العصابات الموجودة على الجل كما هو موضح سابقا. أخيرا ، قم بملاءمة الدورات الزمنية لتكوين المنتج إلى أس واحد لتحديد ثابت معدل الترتيب الأول كما هو موضح في المعادلة التالية.

تم إجراء التحليل الحركي للحالة المستقرة باستخدام 200 نانومولار من ركيزة الحمض النووي وأربعة تركيزات مختلفة من ogg. واحد كما هو محدد من خلال اختبار بروتين برادفورد. تم فصل المنتج المشقوق والركيزة المشقوقة بواسطة الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد.

كانت الدورات الزمنية لتكوين المنتج مناسبة لمعادلة خطية لتحديد تقاطع y ، والتي كانت 2.2 1115 و 26 نانومولار على التوالي بالنسبة لكل تركيز بروتين ، وتم رسم اعتراضات Y بشكل أكبر بالنسبة لكل تركيز بروتين فعلي. تم تحديد جزء الإنزيم النشط ليكون 38٪ من منحدر الخط لتحديد معدل الحالة المستقرة. تم رسم قيم VSS المحددة مسبقا بالنسبة إلى اعتراضات Y.

كان ميل الخط 0.0028 في الثانية ، وهو ما يعادل ثابت معدل التفكك للمنتج الذي يتكون من أنشطة ارتباط DNA Glycosylate. تم اتباع دورة زمنية للحالة المستقرة مسبقا باستخدام 200 نانو مولار ، ركيزة الحمض النووي و 40 نانو مولار نشط OG واحد. يمكن أن تتناسب الدورات الزمنية لتكوين المنتج مع معادلة ذات حدود أسية وخطية صاعدة.

تم تحديد كاي الملاحظة والكوف لهما 0.75 و 0.0055 في الثانية على التوالي. في ظل ظروف دوران فردية ، تم الانتهاء من تفاعل استئصال Oxo g الثماني في غضون ست ثوان. يمكن أن يكون المسار الزمني لتكوين الناتج مناسبا لمعادلة أسية واحدة وينتج عنه K ملحوظ قدره 0.74 في الثانية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخطوات الرئيسية أثناء الدورة التحفيزية وقياس معدلات الكيمياء ودوران الإنزيم.