ميكروفلويديك على رقاقة رد الفعل التقاط-إضافة حلقية لشل حركة عكسية جزيئات صغيرة أو هياكل متعدد المكون للتطبيقات الاستشعار البيولوجي

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار استراتيجية سريعة وقابلة للتعميم لشل حركة الجزيئات الصغيرة والجسيمات النانوية الوظيفية على سطح رقائق المستشعر. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت الأجسام المضادة لضريبة السلع والخدمات أولا على سطح المستشعر. كخطوة ثانية التقاط مستضد ضريبة السلع والخدمات.

مع مجموعات trans cyclo أو octine أو tetra zine ، وتوفر سطحا تفاعليا لتفاعلات إصدار cyclo اللاحقة مع مشتقات جيبية جزيئية صغيرة أو اقتران أوكتان حلقي للجسيمات النانوية ، والتي يتم تشغيلها لاحقا مع مشتقات جيبية جزيئية صغيرة. بعد ذلك ، يمكن استخدام السطح الوظيفي لتحليل التفاعل مع الهدف القابل للذوبان المطلوب. في الخطوة الأخيرة ، يتم تجديد السطح ، مما يتيح دورات الالتقاط اللاحقة لنتائج الربط التي تظهر على التفاعلات المتعامدة الحيوية للسفينة تحافظ على قدرة الجزيئات الصغيرة المجمدة أو جسيمتين نانويتين وظيفيتين على التفاعل مع هدف FK BP 12 وتوضيح كيف يمكن لهذا النهج توسيع نطاق تطبيقات SPR.

تتمثل الميزة الرئيسية لتقنية إصدار دورة الالتقاط على الرقاقة في أنها تتيح العكس السريع وتعبئة الجزيئات الصغيرة مع التحكم في الاتجاه وكثافة التعبئة. عادة ، يمكن إجراء عملية إصدار دورة الالتقاط في غضون دقائق ، مما يقلل بشكل كبير من أوقات تحضير السطح ، مما يدل على أن الإجراء سيكون جيسون ساندلر ، طالب من مختبرنا لبدء هذا الإجراء عند ثمانية ميكرولتر من محلول T-C-O-N-H-S سعة 50 ملليمولار في DMSO إلى 100 ميكرولتر من محلول GST واحد ملليغرام لكل مليلتر في PBS. بعد رج الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، قم بإزالة الكاشف الزائد باستخدام عمود تحلية Zeba Spin.

بعد ذلك ، أضف ستة ميكرولترات من محلول 25 ملليمولار NHS Ester في DMF إلى 75 ميكرولتر من محلول واحد ملليغرام لكل مليلتر من ضريبة السلع والخدمات في PBS ورج الخليط في درجة حرارة الغرفة بعد ساعة واحدة. خفف خليط التفاعل ب 25 ميكرولتر من PBS وقم بتنقية باستخدام عمود تحلية الدوران. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول T-C-O-N-H-S سعة 50 مللي مولار إلى 150 ميكرولتر من محلول الجسيمات النانوية المنبعث ورج الخليط بنفس الطريقة كما كان من قبل.

بعد الخلط ، قم بإزالة الكاشف الزائد عن طريق ترشيح الهلام باستخدام عمود NAP 10. ألمح إلى المخزن المؤقت PBS. اجمع الشريط الملون الذي يحتوي على منتج N-P-T-C-O.

انقل العينة المنقاة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على جهاز مرشح طرد مركزي بقطع الوزن الجزيئي يبلغ 100،000. ثم ركز العينة على حجم نهائي يبلغ حوالي 150 ميكرولتر بعد الطرد المركزي. أضف 50 ميكرولترا من محلول أنهيدريد cynic 0.1 molar في DMSO إلى محلول N-P-T-C-O.

بعد رج الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، قم بتنقية منتج N-P-T-C-O باستخدام عمود NAP 10 المراوغ مع PBS باستخدام البلازما السطحية في أداة الرنين ، حدد الشلل على خليتي التدفق الأولى والثانية في قالب معالج الشلل AM. قم بتعديل طريقة أمين لتنشيط المجموعات الكربوكسيلية السطحية عن طريق حقن محلول واحد لواحد من 0.4 مولار EDC و 0.1 مولار NHS لمدة 480 ثانية. بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة ، اضبط حقن الإيثانول أمين لإخماد الاسترات المنشطة المتبقية على وقت التلامس 422 بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة.

أدخل اسم الترابط المضاد لضريبة السلع والخدمات واضبطه على الحقن لمدة 420 ثانية بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة. بعد ذلك ، ضع قوارير المحلول المعدة مسبقا في رف الكاشف الثاني. التأكد من مطابقة المواضع مع قائمة المحتوى بعد تعيين اسم الملف والوجهة حيث سيتم حفظ البيانات.

ابدأ الشلل. قم بتحرير معالج الشلل لحقن 20 ميكروغراما فقط لكل ملليلتر من محلول ربط ضريبة السلع والخدمات لمدة 420 ثانية بمعدل خمسة ميكرولتر في الدقيقة فوق خلية التدفق المرجعي الأولى. ضع القوارير التي تحتوي على محلول TERAZ olaine 10 ميكرومولار المحضر مسبقا ومحلول التجديد في رف الكاشف الثاني.

حدد طريقة التشغيل اليدوي ، واضبط معدل التدفق على خمسة ميكرولتر في الدقيقة ومسار التدفق إلى خلية التدفق الثانية. قم بحقن محلول G-S-T-T-C-O لمدة 420 ثانية متبوعا بمحلول Teraz Benz Lamine لمدة 600 ثانية. بعد ذلك ، قم بتجديد السطح بحقنتين 32 من محلول التجديد.

بعد وضع قوارير GST TERAZ zine و N-P-T-C-O و teraz Belamine وقوارير محلول التجديد في رف الكاشف الثاني ، حدد طريقة التشغيل اليدوي للأداة ، ثم اضبط معدل التدفق على خمسة ميكرولتر في الدقيقة ومسار التدفق لخلية التدفق الثانية. حقن محلول GST Tetra zine لمدة 60 ثانية ، متبوعا بمحلول N-P-T-C-O لمدة 60 ثانية. أخيرا ، قم بحقن محلول رباعي الزين بيلامين لمدة 60 ثانية.

عند الانتهاء ، قم بتجديد السطح بنفس الطريقة كما كان من قبل. بعد ذلك ، حدد طريقة جديدة وأدخل المعلمات العامة ، والتي تشمل جمع البيانات ، واكتشاف المعدل ، وحجرة العينة ، ودرجة الحرارة ، ووحدات التركيز ، وإعدادات المخزن المؤقت. في لوحة خطوات الفحص، قم بإنشاء خطوة جديدة وقم بتسميته عينة.

ثم قم بتعيين الغرض وتوصيل الإعدادات المستندة إلى عينة في لوحة أنواع الدورات، وقم بإنشاء خطوة دورة جديدة وأدخل الأوامر التالية. التقاط نموذج تجديد واحد والتجديد الثاني. حدد الأمر capture وأدخل G-S-T-T-C-O كرابط.

قم بتسمية 120 ثانية كوقت الاتصال ، وخمسة ميكرولتر في الدقيقة كمعدل تدفق. واضبط مسار التدفق على الثانية. ثم حدد أمر العينة وأدخل وقت الاتصال 182 ، ووقت التفكك 62 ، ومعدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة وقم بتعيين مسار التدفق على كليهما.

بعد ذلك ، حدد الأمر regeneration one وأدخل حل التجديد. قم بتسمية وقت التلامس 32 بمعدل 30 ميكرولتر في الدقيقة واضبط مسار التدفق على الثانية. كرر نفس الإجراء للتجديد.

أمران يختاران تعيين مسار التدفق وتشغيله وتعيينه إلى شرطتين واحد. حدد التالي واملأ قائمة العينات بمحلول تحليل tetra Belamine وسلسلة تركيز من 1.5 إلى 20 ميكرومولار عند تخفيف واحد إلى اثنين. ثم حدد بجوار لوحة موضع الحامل.

بعد ضبط قوارير المحلول في رف الكاشف الثاني ، ضع سلسلة التخفيف. في طبق 96 بئر. تأكد من مطابقة المواضع مع قائمة المحتوى.

احفظ قالب الطريقة وابدأ مقايسة الربط. لنفترض بمجرد تحديد طريقة جديدة والمعلمات العامة، قم بإنشاء عينة الالتقاط وخطوات التجديد وتسميتها في لوحة خطوات الفحص. بعد ذلك ، حدد الغرض المقابل وقم بتوصيل إعدادات القاعدة.

ثم حدد لوحة أنواع الدورة وقم بإنشاء ثلاث خطوات دورة. الالتقاط وأخذ العينات والتجديد. أدخل أمر الالتقاط مرتين ضمن دورة الالتقاط.

ادخل في لوحة التقاط واحدة. حدد حل الالتقاط كمتغير. ثم اضبط وقت التلامس على 300 ثانية بمعدل تدفق يبلغ خمسة ميكرولتر في الدقيقة واضبط مسار التدفق على الثانية في لوحة الالتقاط الثانية.

حدد حل الالتقاط كمتغير. اضبط وقت التلامس على 250 ثانية بمعدل تدفق خمسة ميكرولتر في الدقيقة واضبط مسار التدفق على الثانية. بعد ذلك، أدخل الأمر العينة ضمن خطوة دورة العينة.

حدد لوحة العينة واضبط وقت الاتصال على 60 ثانية. وقت التفكك إلى 200 ثانية بمعدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة وتعيين مسار التدفق على كليهما. أدخل أمر التجديد مرتين ضمن خطوة دورة التجديد ، وحدد لوحة التجديد ، وأدخل حل التجديد.

قم بتسمية وقت التلامس البالغ 30 ثانية بمعدل 30 ميكرولتر في الدقيقة ، واضبط مسار التدفق على الثانية. كرر نفس الإجراء للتجديد. تقوم لوحتان بتحديد مسار التدفق وتشغيلهما وتعيينهما إلى شرطتين ، أحدهما حدد التالي وأدخل G-S-T-T-C-O و teraz AP 1 ، 497 مترافقان حيث يسمي حل الالتقاط FKBP 12 كاسم العينة و 1.5 إلى 96 نانو مولار عند تخفيف واحد إلى اثنين كسلسلة تركيز.

بعد وضع قوارير المحلول في رف الكاشف الثاني وسلسلة التخفيف في لوحة بئر 96 ، احفظ قالب الطريقة وابدأ مقايسة الربط. يلعب التثبيت الفعال القابل للعكس للجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا مع التحكم في الاتجاه والكثافة دورا رئيسيا في تطوير تطبيقات جديدة للاستشعار الحيوي. يظهر هنا المراقبة في الوقت الفعلي لتثبيت teraz zine Benzoin.

يتم حقن محلول G-S-T-T-C-O على سطح مضاد لضريبة السلع والخدمات تم تثبيته مسبقا مما يؤدي إلى ارتفاع ما يقرب من 400 R RU. ردا على ذلك ، تظهر الحقنة الثانية مع Teraz zine Benzo Lamine ارتفاعا سريعا بمقدار 15 RU استجابة لذلك. لم يلاحظ أي تفكك في مستضد dert بعد التحول إلى المخزن المؤقت الجاري ، مما يوفر دليلا على استقرار الهيكل.

تم تجديد السطح في الخطوة الأخيرة من الدورة لتمكين دورات إصدار cyclo متعددة الالتقاط. باستخدام هذا الإجراء واستبدال رباعي الزين ، يولد جزء البنزيل لامين مع مترافق teraz zine AP 1 ، 497 سطحا نشطا بيولوجيا ، والذي يستخدم لدراسات التفاعل مع هدفه. يؤدي اضطراب FK BP 12 لتفاعل مستضد الجسم المضاد إلى تجديد السطح المضاد لضريبة السلع والخدمات ، مما يسمح ببناء مجموعة جزيئية جديدة.

في هذه الحالة ، يتم اتباع حقن GST teraz zine بحقن N-P-T-C-O ، مما يؤدي إلى تثبيت الجسيمات النانوية بشكل فعال على سطح المستشعر. تتوفر مجموعات TCO غير المتفاعلة على الجسيمات النانوية لإصدار cyclo مع حقن teraz zine benzo lamine. بدلا من ذلك ، يتم استخدام مترافق TET INE AP 1 ، 497 لمراقبة تفاعلات الجسيمات النانوية الوظيفية FK BP 12.

لم يلاحظ أي تفكك للهياكل متعددة المكونات ، مما يوفر دليلا على استقرار الهيكل والنشاط الحيوي مع قدرات على مراقبة تفاعل الشلل في الوقت الفعلي وتجديد السطح. يتم التوصيف المباشر لمعدل الارتباط KA كما هو موضح هنا. توفر معرفة حركية التفاعل إرشادات للتحكم في كثافة الشلل ومعلمة مهمة لمقايسات المستشعرات الحيوية.

حقن تركيزات متزايدة من teraz BELAMINE أو N-P-T-C-O في نسختين على أسطح G-S-T-T-C-O أو GST teraz zine على التوالي إلى إنشاء بيانات الربط. بيانات الربط لعينتين تحليليتين متتابعتين من نفس التركيز على نفس السطح تكاد تكون محالة للغاية مما يعكس الحد الأدنى من فقدان قدرة ربط الجسم المضاد. نظرا للدورات المتعددة لإصدار cyclo الالتقاط وتجديده ، يوفر برنامج التقييم أفضل تحليل حركي مناسب لمعدلات تفاعل إصدار cyclo.

لقد طورنا نهجا يستخدم التقاط مستضد الأجسام المضادة ، إلى جانب تفاعلات إصدار cyclo السريعة والمحددة للغاية بين teraz zine و transcycline التي تتيح تثبيت الجزيئات الصغيرة بسرعة قابلة للعكس. بالنسبة للدراسات القائمة على رقاقة SPR ، تتطلب طريقة إصدار دورة الالتقاط أوقات تلامس قصيرة مع أقل من 10 تركيزات ميكرومولار من روابط الجزيئات الصغيرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية شل حركة الجزيئات الصغيرة أو الهياكل متعددة المكونات على سطح المستشعر باستخدام طريقة إصدار cyclo الالتقاط.

من أجل تحقيق ذلك ، من المهم استخدام كواشف ذات نوعية جيدة لتفاعلات الاقتران وإعداد معلمات الفحص بشكل صحيح على أداة SPR.