نظام Coculture مع عضوي النمط شريحة الدماغ و 3D كروي من خلايا سرطان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور التفاعلات الدبقية مباشرة أثناء تكوين ورم خبيث دماغي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير شرائح الدماغ العضوية أولا من الفئران. بعد ذلك ، يتم زراعة شرائح الدماغ العضوية مع خلايا السرطان.

ثم يتم تلطيخ الخلايا اللحمية بالفلورسنت بعلامات محددة. أخيرا ، يتم تقييم مستوى غزو الورم بالمجهر الفلوري. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تفاعل الخلايا الدبقية السرطانية وتحديد الموقع من خلال وضع العلامات على التألق المناعي والفحص المجهري بفاصل زمني أو متحد البؤر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الحقن داخل المخ لخلايا السرطان ، هي أن هذه الطريقة هي بديل سهل وتوفر منصة جيدة لمراقبة التفاعلات الخلوية أثناء تطور الورم. الآثار المترتبة على هذه التقنية هي 10 نحو اكتشاف علاجات جديدة وانتقائية لعلاج السرطان. نظرا لأن خلايا الصدمة تلعب أدوارا مهمة في ورم خبيث وأيضا الأهداف المحتملة لعلاج السرطان ، فإن إثبات هذه التقنية سيكون يوجينيا تسلم ما بعد الدكتوراه في مختبري قبل الإجراء الجراحي ، قم بإعداد وسط التشريح الذي يتكون من الحد الأدنى من الوسط الأساسي ، مع 0.2 ملليمولار من الجلوتامين ، و 100 ملليغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين ، و 4.5 ملليغرام لكل مليلتر من الجلوكوز بعد قطع رأس الفئران من أي سلالة فئران بين اليوم السادس بعد الولادة و تمانية.

باستخدام الظروف المعقمة بسرعة ، قم بإزالة الدماغ من الجمجمة ونقله إلى وسط التشريح. قم بإزالة العمود الأمامي والمخيخ من الدماغ. ثم استخدم الغراء بالتبريد و 5٪ agros لإصلاح وتثبيت أنسجة المخ المتبقية المكونة من المخ.

على المسرح باستخدام شريحة Vibram أفقيا ، تجمع الأقسام بسمك 350 ميكرون ، اعتمادا على نوع الفأر وعمره ، من أربع إلى ست شرائح دماغية كاملة من دماغ واحد. بعد تحضير وسط الثقافة وفقا لبروتوكول النص ، أضف ملليلترا واحدا إلى كل بئر سفلي من صفيحة بئر مكونة من ستة آبار. ثم ضع كل شريحة دماغية عضوية على غشاء بولي كربونات 0.4 ميكرون وأدخلها في آبار اللوحة.

احتضان الشرائح طوال الليل في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتضمين 10 إلى الورم الخامس GFP المنقول أو الخلايا الأخرى في 20 ميكرولترا من مصفوفة الجل التي تتكون من 15٪ RPM متوسط و 85٪ جل ECM. ضع مزيج مصفوفة الهلام السبعة MCF في فواصل معدنية معقمة مجاورة مباشرة للمناطق القشرية لشرائح الدماغ العضوية واحتضانها لمدة ساعتين بعد الحضانة ، وقم بإزالة الفواصل والسماح للورم ثلاثي الأبعاد PHE بالتحتضن مع شرائح الدماغ لمدة 24 إلى 96 ساعة.

استبدل وسط الاستزراع كل يومين إذا رغبت في ذلك. قم بإجراء التصوير المباشر باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني مع كائن تكبير 10 × لتلطيخ الثقافات المشتركة لشريحة الدماغ. قم بإصلاحها باستخدام 4٪ ألدهيد بارافورم لمدة ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية قبل غسل العينات في PBST لمدة خمس دقائق.

ثم لمنع العينات ، استخدم مصل الماعز العادي في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا النجمية عن طريق احتضان المزارع المشتركة بالبروتين الحمضي الليفي الدبقي أو الجسم المضاد أحادي النسيلة GFAP لمدة 36 ساعة عند أربع درجات مئوية ، متبوعا بتلطيخ الماعز المضاد للفأر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ، قم بتلطيخ الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام I LB four LOR 647 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل تلطيخ مضاد باستخدام DPI لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد استخدام وسيط تركيب الفلورسنت لتركيب عينات الزراعة المشتركة ، قم بتصوير العينات باستخدام مجهر فلوري بتكبير 25 ×. أخيرا ، قم بتقييم درجة غزو الورم بناء على نظام التسجيل التالي. يقيس هذا أولا طول قسم التلامس بين سدادة الورم والشريحة ، ثم جزء التلامس الذي يمكن اكتشافه بواسطة الخلايا الغازية.

كما هو موضح هنا ، غزت جميع خطوط خلايا السرطان التي تم اختبارها شرائح دماغ الفأر العضوية مما يشير إلى أن عملية الغزو كانت مستقلة عن الأنواع. يعرض هذا الفيلم تسجيلا بفاصل زمني لتفاعلات الخلايا الورمية الدبقية المباشرة. لوحظ أن الخلايا اللحمية تغزو الورم الذي يحتوي على سدادة خلوية وتتفاعل مع الخلايا السرطانية.

أكد التصوير بفاصل زمني على مدى فترة طويلة من الزمن جدوى شرائح الدماغ ، وسمح بتصور الخلايا الدبقية الصغيرة التي تدخل المجال ثلاثي الأبعاد ، وكذلك الخلايا السرطانية التي تغزو شرائح الدماغ. علاوة على ذلك ، كما أوضحنا سابقا الخلايا الدبقية الصغيرة تنقل خلايا سرطان الدم من خلال آلية لا تزال غامضة وتساعد في غزو السرطان باستخدام وضع العلامات على التألق المناعي. لقد أظهرنا التوطين المشترك للخلايا السرطانية واللحمية في كل من أنسجة المخ وسدادات الخلايا السرطانية ، مما يشير إلى تفاعل محكم بين هذه الخلايا أثناء عملية الغزو.

كما يتضح من هنا ، تم الحصول على نتائج قابلة للمقارنة عندما تم زراعة شرائح دماغ الفأر بشكل مشترك مع خلايا سرطان الإنسان أو البول ، مما يدعم مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة الخلايا من الأنواع المختلفة والأنماط الجينية والسلالات. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ورم خبيث للسرطان لاستكشاف تأثير البيئة المكروية أثناء استعمار الورم في المواقع البعيدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تفاعلات الخلايا السرطانية GL أثناء تكوين ورم خبيث في دماغ الخلية في نظام اتصال فسيولوجي مباشر.