رواية ضوء بارادايم ضرر للاستخدام في دراسات التجديد الشبكية في اسماك الزرد الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو الدمج بين بروتوكولين سابقي الوصف للتنكس الشبكي المستحث بالضوء، وذلك لإتلاف كل من المستقبلات الضوئية العصوية والمخروطية في جميع أنحاء الشبكية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تعريض أسماك الزيبرا البالغة والمتكيفة مع الظلام أولاً للأشعة فوق البنفسجية (UV light) لمدة 30 دقيقة. وتتمثل الخطوة الثانية في نقل الأسماك المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية فوراً إلى أحواض محاطة بأربعة مصابيح هالوجين بقدرة 250 watt، وتعريض الأسماك لضوء مستمر لمدة تصل إلى أربعة أيام.

تتمثل الخطوة النهائية في قتل الأسماك رحيمًا واستخراج نواة العين لإجراء مزيد من التحليلات. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري المناعي لإظهار الفقدان المستمر لكل من المستقبلات الضوئية العصوية والمخروطية في جميع أنحاء الشبكية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية أو المعالجة بمصباح الهالوجين، في أن الجمع بين هاتين الطريقتين يؤدي إلى استئصال كل من المستقبلات الضوئية العصوية والمخروطية في جميع أنحاء الشبكية.

يؤدي تلف المستقبلات الضوئية إلى استجابة تكاثر واسعة النطاق تؤدي في النهاية إلى تجديد المستقبلات الضوئية المفقودة. ستقوم جنيفر توماس، طالبة الدراسات العليا في مختبري، بتوضيح هذه التقنية. للبدء، استخدم طبق بتري زجاجي مقلوب بقطر 15 centimeter لاستخدامه كقاعدة، وقم بتثبيته على طاولة المختبر باستخدام شريط لاصق لتعريضه للأشعة فوق البنفسجية UV.

قم بإزالة فتيل الضوء فوق البنفسجي (UV) من المجهر المجسم الفلوري. بعد ذلك، قم بتثبيت فتيل الضوء فوق البنفسجي بالشريط اللاصق فوق أطباق بيتري المقلوبة، مع ترك حوالي 2 ملم من طرف الفتيل يتدلى فوق طبق بيتري. بعد ذلك، قم بتغطية نصف الجوانب السفلية والجزء الخلفي من كؤوس زجاجية سعة 250 مل بورق الألومنيوم، مع التأكد من أن الجانب اللامع من الورق يواجه الجزء الداخلي من الكأس.

بعد ذلك، املأ الكأس بـ 100 milliliters من الماء المستمد من نظام منشأة الأسماك. ضع هذا الكأس داخل كأس سعة أربعة لترات. ثم املأ الكأس سعة أربعة لترات بالماء حتى يصبح مستوى الماء متساوياً مع خط علامة 100 milliliter الموجود في الكأس سعة 250 milliliter.

عند وضع حد أقصى يبلغ 10 أسماك معالجة بالظلام في الكأس سعة 250 milliliter، يتم تغطية الكأس سعة 250 milliliter بقطعة صغيرة من ورق الألمنيوم. بعد ذلك، ضع جهاز الكأس بالكامل بجوار فتيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) مباشرةً. يجب أن يلامس الفتيل الجزء الخارجي من الكأس سعة 4 liter ويكون مواجهاً للجزء المكشوف من الكأس سعة 250 milliliter.

تأكد من وضع الكأس الزجاجي سعة 250 milliliter في مركز قاع الكأس الزجاجي سعة four liter. بعد ذلك، ضع شاشة كبيرة معتمة خلف الكأس الزجاجي سعة four liter، بحيث تسمح بتعرض الحيوانات للأشعة، ولكنها تمنع أي من موظفي المختبر من رؤية طرف فتيل UV. ثم قم بتشغيل مصدر طاقة UV.

اضبط المؤقت لمدة 30 دقيقة وضع ملصقات التحذير اللازمة لضمان عدم تعرض أفراد المختبر غير المدركين للإشعاع فوق البنفسجي عن طريق الخطأ. بعد مرور 30 دقيقة، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة للأشعة فوق البنفسجية. ثم أخرج البيكر سعة 250 milliliter الذي يحتوي على الأسماك.

في هذا الإجراء، انقل الأسماك من البيكر سعة 250 milliliter إلى حوض أسماك من الأكريليك الشفاف سعة 1.8 liter. بعد ذلك، املأ الحوض حتى علامة التدفق لتهيئة منطقة المعالجة بضوء مصابيح الهالوجين. ضع مصباحين هالوجين للأعمال العامة بقوة 250 في نفس الاتجاه وعلى مسافة 29 centimeters من الحوض.

ثم ضع المصباحين الآخرين بطريقة مماثلة على الجانب المقابل، مع ترك مسافة 73 centimeters تقريبًا بين مجموعتي المصابيح. بعد ذلك، ضع المروحة في منتصف المسافة بين مجموعتي المصابيح خارج منطقة المعالجة الضوئية مباشرةً. وفي وقت لاحق، ضع خزانين سعة 1.8 liter مملوئين بالماء في مركز منطقة المعالجة الضوئية، بحيث يكونان على مسافة متساوية بين مجموعتي المصابيح.

ثم ضع جهاز تهوية بالأكسجين في كل خزان. غطِّ كل خزان بأغطية من الأكريليك الشفاف، مع ترك فجوة بمقدار 2 cm عند الطرف الأقرب إلى المروحة. رتّب المروحة بحيث تدفع الهواء داخل هذه الفجوة، وضع ميزان حرارة في أحد الخزانين أو كليهما.

بعد ذلك، قم بتشغيل الطاقة للمصابيح والمروحة وأجهزة التهوية. استمر في المعالجة الضوئية لمدة تصل إلى أربعة أيام. يجب عدم إطعام الأسماك أثناء المعالجة الضوئية، لأن ذلك سيؤثر على جودة المياه ويؤدي إلى زيادة إجهاد الحيوانات.

راقب درجة الحرارة ومستوى الماء بشكل يومي وحافظ على درجة الحرارة بين 30 إلى 33 درجة Celsius. إذا لزم الأمر، اضبط سرعة المروحة والمسافة بين الخزانات والمصابيح. قم أيضاً بملء كل خزان بمياه النظام يومياً.

بعد مرور 48 ساعة من بدء المعالجة بضوء الهالوجين، أخرج الأسماك من منطقة المعالجة. بعد ذلك، قم بتحضير محلول إيثانول فورمال طازج كمثبت نسيجي، ثم قم بقتل أسماك الزيبرا عن طريق جرعة زائدة من التخدير باستخدام tricaine methanesulfonate. بعد ذلك، انقل أسماك الزيبرا الميتة إلى منشفة ورقية، ثم قم باستئصال العين باستخدام ملقط منحني.

يُحفظ كل من العيون المنواة والمثبّت طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في مبرد (cryo). يتم حماية العيون، ثم غسلها في محلول 5% sucrose في 1X PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، استبدله بمحلول 5% sucrose في 1X PBS طازج واترك العيون لمدة ساعتين. وبعد مرور الساعتين، اغسل العيون في محلول 30% sucrose في 1X PBS طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اغسل العيون في محلول مكون من مزيج بنسبة واحد إلى واحد من وسط تجميد الأنسجة ومحلول 30% sucrose في 1X PBS طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، يتم غمر العيون في وسط تجميد أنسجة بتركيز 100% مع توجيهها وفق المحور الظهري البطني. ثم تُخزن في درجة حرارة 80- درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل إجراء القطع بالتجميد للأنسجة. والآن، يتم تقطيع الأنسجة بالتجميد ووضعها على شرائح زجاجية.

بعد ذلك، يتم تدفئة الشرائح لمدة ساعتين عند 55 °C. بعد ذلك، تُخزن الشرائح عند -80 °C أو يتم إجراء تحليل كيميائي نسيجي مناعي قياسي فوراً والتصوير باستخدام المجهر الفلوري. يوضح هذا الشكل التغييرات في استجابة التكاثر عقب نماذج مختلفة من التلف الضوئي.

تظهر هنا مقاطع شبكية لسمكة الزيبرا البالغة من السلالة المهقنة، والموسومة مناعياً بـ PCNA لإظهار تكاثر الخلايا الموضح باللون الأحمر في النصفين الظهري والبطني من الشبكية عقب نماذج مختلفة من التلف الضوئي عند الساعة صفر. كان التكاثر غائباً في الطبقة النووية الخارجية عند 48 HLT. كما وجدت خلايا سلفية منفردة في INL عبر الشبكية الظهرية، وفي جزء صغير من الشبكية البطنية.

في الساعة 48 HPUV، كانت أعمدة من الخلايا السلفية موجودة في الشبكية الظهرية، بينما وجدت خلايا سلفية مفردة فقط في جزء صغير من الشبكية البطنية. وفي الساعة UV plus 48، كانت هناك أعمدة كبيرة من الخلايا السلفية منتشرة عبر الشبكية الظهرية والبطنية.

يوضح هذا الشكل فقدان المستقبلات الضوئية العصوية والمخروطية في أسماك الزيبرا المصبغة بعد نماذج مختلفة من التلف الضوئي. تظهر هنا المقاطع الشبكية المصبوغة بـ Pro three لإظهار النوى باللون الأزرق، والموسومة مناعيًا بـ zpr R three لإظهار القطع الخارجية للعصويات باللون الأرجواني أو zpr R one لإظهار المخاريط المزدوجة باللون الذهبي بعد كل نموذج من نماذج التلف الضوئي. لوحظ انخفاض ملحوظ في نوى المستقبلات الضوئية العصوية في الشبكية الظهرية عند 48 HLT وفي الشبكية الظهرية والبطنية عند UV plus 48 HLT.

على الرغم من تضخم النوى في الشبكية الظهرية عند 48 HPUV، لم تكن هناك انخفاضات ملحوظة في نوى المخاريط المزدوجة عند 48 HLT أو 48 HPUV. وقد لوحظت انخفاضات كبيرة في النوى في الشبكية الظهرية والبطنية عند UB زائد ثماني H lt. إن دمج هذا الإجراء مع طرق أخرى، مثل المثبطات الصيدلانية المحددة للجينات أو تثبيط البروتين في الجسم الحي، يمكن أن يكشف عن دور الجينات الفردية في تنكس المستقبلات الضوئية واستجابة التجدد اللاحقة.