التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الأنفلونزا المنقاة المطوية بشكل صحيح والهيماجلوتينين والبروتين السكري السطحي النيورامينيداز للمقايسات المناعية وتجارب التطعيم. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنساخ BMid المؤتلف الذي يحمل جينات الأنفلونزا أولا ، يليه توليد فيروسات الباولا المؤتلفة. الخطوة الثانية هي استخدام فيروسات الباولا المؤتلفة هذه للتعبير عن بروتينات الهيماجلوتينين والنورامينيداز في خلايا الحشرات.

بعد ذلك ، يتم تنقية البروتينات المؤتلفة من المادة الطافية لزراعة الخلية باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. الخطوة الأخيرة هي توصيف هذه البروتينات لضمان الجودة الجيدة والوظائف البيولوجية. في النهاية ، تستخدم البروتينات المؤتلفة للتحقيق في الاستجابات المناعية للبروتينات السكرية السطحية لفيروس الأنفلونزا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعبير البكتيري عن HA one ، على سبيل المثال ، هي أن المستضدات المنقاة مطوية بشكل تصحيحي وتظل نشطة بيولوجيا أيضا ، بدلا من استخدام مستحضرات الفيروس الكاملة للمقايسات المناعية. تسمح هذه الكواشف بقياس الاستجابات المناعية ضد بروتينات الهيماجلوتينين وغير النيورامينيداز. ابدأ هذا البروتوكول فقط بتوليد فيروس باولا المؤتلف كما هو موضح في بروتوكول النص الذي يعمل بشكل معقم في صفيحة غطاء التدفق الصفحي ، وتسع خلايا حشرية SF في ست ألواح آبار بكثافة 200 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع.

ودعونا نجلس لمدة 20 دقيقة في حاضنة 28 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2. ثم امزج ميكروغرامين من منتصف الظهر المؤتلف مع 100 ميكرولتر من تركيبة Trico Leia للركبة متوسطة HINK أو TNM fh. ثم امزج ستة ميكرولترات من عامل التعدي مع 100 ميكرولتر من وسط الحشرات TNM FH.

يمزج المجلدان ويخلط برفق ويترك خليط التعداء لمدة 20 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتضمين تعداء وهمي واحد كعنصر تحكم ، والذي يحتوي على كاشف التعدي ولكن لا يحتوي على الحمض النووي. قم بإزالة SNAT من خلايا SF التسع المطلية واستبدلها بملليلترين من وسط TNM FH الخالي من المصل الذي يحتوي على محلول ستربتومايسين 1٪ بنسلين.

أضف الحجم الكامل لخليط التعداء إلى الخلايا وهز لوحة الآبار الستة بعناية لمدة خمس ثوان. احتضن في حاضنة 28 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ست ساعات. استبدل الوسائط بوسائط TNM FH كاملة جديدة قبل احتضان اللوحة في نفس الظروف لمدة ستة أيام.

افحص الخلايا من حين لآخر تحت المجهر. عادة ما تظهر الخلايا المصابة أكبر. تضخمت النوى المستديرة وتبدأ في الانفصال.

حصاد الخلايا بعد ستة أيام من التعداء عن طريق الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يحتوي المادة الطافية على فيروس الباولا المؤتلف وسيتم استخدامه لتوليد مخزونات عاملة على الفور ، أو يمكن تخزينها عند أربع درجات مئوية لسنوات. تحقق من تعبير البروتين عبر صفحة SDS واللطخة الغربية وقم بإعداد مخزون العمل كما هو موضح في بروتوكول النص.

تدعم الخلايا التسع SF نمو الفيروس البقعي بشكل جيد للغاية. ومع ذلك ، فإن قدرتها على إفراز كميات كبيرة من البروتين المؤتلف محدودة. لذلك ، نستخدم خط خلايا حشرات آخر.

خلايا عالية للتعبير عن البروتينات المؤتلفة المفرزة. لا تدعم هذه الخلايا نمو فيروس البالو إلى عيارات عالية ، لكن لديها قدرة إفرازية عالية جدا. تنمو خمس خلايا عالية في وسط زراعة خلايا الحشرات SFX في ممر قوارير T 175 سنتيمترا مربعا كل يوم.

تقسيمها بنسبة واحد إلى ثلاثة. قم بزراعة خمس قوارير ملتصقة لثقافة تعبير 200 مل لحصاد الخلايا الخمس العالية وإصابة المرضى. أولا ، افصل الخلايا الخمس العالية عن طريق النقر على القوارير.

اجمع تعليق الخلية وانقله إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل. قم بتدوير الأنابيب عند 1200 جم لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق صب وتوحيد الكريات عن طريق إعادة التشكيل ، مع تعليقها في 15 مل من مخزون P ثلاثة.

دع الخلايا تجلس لمدة 15 دقيقة في غطاء التدفق. انقل 200 مل من وسط ثقافة SFX عالي الاستنساخ إلى قارورة شاكر نظيفة ومعقمة سعة 1000 مل. ثم انقل نظام التعليق P ثلاثي الخلايا إلى ختم قارورة شاكر بورق ألومنيوم معقم قبل الاهتزاز عند 70 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة.

لحصاد البروتين المؤتلف من المواد الطافية عالية التعبير عن خمس خلايا في 72 إلى 96 ساعة بعد الإصابة. نقل المواد الطافية المزرعة إلى دلاء الطرد المركزي سعة 500 مل. تدور عند 5،500 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

في غضون ذلك ، اشطف قارورة شاكر ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج. الماصة التالية. ثلاثة ملليلتر من ملاط راتنج النيكل في أنبوب سعة 50 مليلتر مع 45 مل من PBS لكل 200 مل من الثقافة.

يرج جيدا قبل الدوران لمدة 10 دقائق عند 3000 جم ودرجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي. صب PBS واحتفظ بالحبيبات. امزج المادة الطافية لخلية الحشرات مع حبيبات راتنج النيكل وانقله إلى قوارير شاكر مغسولة بالفعل.

احتضن عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات أثناء الرج. بعد ذلك ، قم بتركيب عمود بولي بروبيلين سعة 10 ملليلتر على مشبك على حامل دعم. قم بإزالة كلا القبعين وضع دورق أسفل العمود لتجميع التدفق من خلاله.

بعد حضانة قارورة الخلاط ، ابدأ في نقل خليط الملاط الطافي إلى العمود. سيحتفظ براتنج النيكل وسيتدفق من خلاله المادة الطافية فقط. مرر وحدة التخزين بأكملها فوق العمود.

اغسل الراتنج أربع مرات باستخدام 15 مل من محلول الغسيل. دع مخزن الغسيل يستنزف من العمود وأغلق الجانب السفلي بالغطاء. أضف ملليلترين من المخزن المؤقت الإيلوسي ودعنا نجلس لمدة خمس دقائق.

افتح العمود واجمع الإيت ، واحتفظ به على الجليد الرطب كلما أمكن ذلك. كرر هذا ثلاث مرات أخرى. عادة ما يظهر EIT الذي يحتوي على تركيزات عالية من البروتين رغوة عند رجها لتبادل المخزن المؤقت وتركيز البروتين أولا ، وحدات الطرد المركزي فائقة الترشيح 15 مليلتر مع PBS عند 3000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

تجاهل التدفق من خلال وقم بتحميل EIT على عمود الدوران. املأ العمود بخمسة ملليلتر من PBS المثلج المعقم قبل الدوران في نفس الظروف لمدة 60 دقيقة. قم بتفريغ التدفق مرة أخرى ، وأعد تعبئته ب 15 مل من PBS المثلج البارد وقم بتدويره لمدة 60 دقيقة إضافية.

كرر هذا الإجراء مرة أخرى ، ثم جمع التركيز الذي تم تبادله للمخزن المؤقت والذي يمثل البروتين المؤتلف عالي التركيز. حافظ على التركيز على الثلج في جميع الأوقات. اشطف عمود الدوران ب 400 ميكرولتر من PBS المثلج المعقم وأضفه إلى المركز.

يمكن بعد ذلك وصف البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. أظهرت بروتينات HA و NA التي عبرت عنها سلالات ENUE و Shanghai مستويات تعبير معتدلة تتراوح من 0.2 ملليغرام لكل لتر مزرعة للأنفلونزا A التي تم جمعها في شنغهاي إلى 0.7 ملليغرام لكل لتر للأنفلونزا. أظهرت جزيئات enue أو neuraminidase أو NA التي تم جمعها في كلتا السلالتين مستويات تعبير معتدلة تتراوح من 0.2 ملليغرام لكل لتر مزرعة للأنفلونزا A التي تم جمعها في شنغهاي إلى 0.7 ملليغرام لكل لتر للإنفلونزا A التي تم جمعها في enue.

تحتوي جميع مستحضرات البروتين الأربعة على شوائب قليلة جدا أو معدومة مع كون has أعلى نقاء من nas ، وهو ما يمكن تفسيره بمستوى التعبير. تم تحليل الإنفلونزا A التي تم جمعها في شنغهاي HA باستخدام ELI SA مع الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري التفاعلي CR 9 1 1 4. كما هو موضح هنا باللون الأزرق ، يرتبط هذا الجسم المضاد أحادي النسيلة بحتمة تأكيدية حساسة في مجال المخزون ويستخدم هنا كمسبار للطي الصحيح لهذا المجال.

يظهر الجسم المضاد ارتباطا جيدا كما يتضح من زيادة الامتصاص عند 490 نانومتر ، مما يعطي الثقة في أن HA مطوي بالفعل بشكل صحيح. ثانية ، إليزا مع مضاد للهيماجلوتينين من النوع الفرعي السابع مصل الفئران متعدد النسيلة تم إجراؤه لتأكيد هوية البروتين الذي تم الحصول عليه على أنه هيماجلوتينين من النوع الفرعي السابع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن فيروس الأنفلونزا المؤتلف والهيماجلوتينين وبروتينات النورامينيداز في مختبرك.

قد تكون هذه العملية مفيدة أيضا للتعبير عن بروتينات الغشاء الفيروسي أو الخلوي الأخرى. أتمنى لك حظا سعيدا في تجاربك.