إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق
يناير 13, 2014
وقد تم إعداد عالية الجودة مجموع الحمض النووي الريبي من أجسام الخلايا من الخلايا العصبية الحركية الحبل الشوكي الماوس عن طريق الليزر التقاط microdissection بعد تلطيخ أقسام الحبل الشوكي مع أزور B في الإيثانول 70٪. يتم استرداد ما يكفي من الحمض النووي الريبي (~ 40-60 نانوغرام) من الخلايا العصبية الحركية 3000-4000 للسماح تحليل الحمض النووي الريبي المصب من قبل RNA-seq وqRT-PCR.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استعادة الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي دون تلوث بالحمض النووي الريبي من الخلايا المجاورة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استعادة السلك وتقسيمها وتضمينه أولا في وسط تضمين التبريد والتجميد عند سالب 160 درجة مئوية. الخطوة الثانية هي تقسيم السلك بالتبريد على شرائح غشاء القلم عند سالب 20 درجة مئوية.
بعد ذلك ، يتم غسل الشرائح بنسبة 70٪ من الإيثانول وتلطيخها ب Azure B بنسبة 70٪ من الإيثانول. الخطوة الأخيرة هي التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لأجسام الخلايا العصبية الحركية المحددة في المخزن المؤقت لتحلل ثيوسيانات غينيا. في النهاية ، يتم تحضير الحمض النووي الريبي الكلي من المحللات المدمجة واختباره للكشف عن الاختلافات في نسخ الحمض النووي الريبي العام أو المحدد في الخلايا العصبية للحيوانات الطافرة مقابل البرية.
يسمح التشريح المجهري لالتقاط الليزر باستعادة أجسام الخلايا العصبية الحركية من أقسام الحبل الشوكي دون تلوث بعدد سكاليا وأنواع الخلايا الأخرى. إتاحة الفرصة لتحضير الحمض النووي الريبي ومقارنة النسخ بين الخلايا العصبية من مريض طبيعي. كان أصعب جانب في تطوير هذا الإجراء هو إيجاد طريقة تلطيخ تسمح لنا باكتشاف الخلايا العصبية الحركية في أقسام الحبل الشوكي مع الحفاظ على مستويات عالية من سلامة الحمض النووي الريبي والقدرة على الاستخراج ، قبل وأثناء التقاط الليزر.
وجدنا أن أقسام التلوين في Azure B و 70٪ من الإيثانول تفي بهذه المعايير عند دمجها مع مجموعة أجسام الخلايا المقطعة مباشرة في Guine Thiocyanate Solution Buffer الذي يوضح الإجراء هو في Van Padia ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا للحصول على أفضل النتائج. تأكد من تنظيف جميع المعدات بمحلول تطهير الحمض النووي الريبي متبوعا بالحمض النووي الريبي الخالي من الإيثانول بنسبة 70٪ بعد القتل الرحيم والتروية القلبية العابرة عزل الحبل الشوكي بعناية. اشطف السلك لمدة 10 ثوان في الحمض النووي الريبي.
الماء الحر لغسل أي دم متبقي ووضعه على شريحة زجاجية خالية من الحمض النووي الريبي برفق شديد ولكن بسرعة. بعد ذلك ، قسم الحبل الشوكي بشكل عرضي باستخدام شفرة حلاقة نظيفة إلى تسع إلى 10 قطع. ضع القطع في قالب تبريد مملوء ب OCT وقم بمحاذاة رأسيا باستخدام إبرة نظيفة.
ضع القالب في صينية ضحلة تحتوي على قطعتين من ميثيل البوتان المبردة مسبقا مع النيتروجين السائل. لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي ، ضع الدرج في حمام النيتروجين السائل. لتجميد قطع الحبل الشوكي بسرعة.
قم بتخزين كتلة OCT المدمجة عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر قبل التقسيم. عندما تكون جاهزا لموضع التقسيم ، فإن كتلة OCT مدمجة في ناظم التبريد المبرد. إنتاج شرائح 20 ميكرون تحتوي كل منها على تسعة إلى 10 مقاطع عرضية للحبل الشوكي.
ضع الأقسام على غشاء القلم الخالي من الحمض النووي الريبي. تم الاحتفاظ بشريحتين ميكرونتين في البداية في درجة حرارة الغرفة لضمان التصاق الأقسام. حسنا ، أعد تجميد القسم على الفور على سطح سالب 20 درجة مئوية داخل ناظم البرد.
احتفظ بالشرائح عند سالب 80 درجة مئوية حتى تستخدم على نطاق رف نظيف. ستة أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر مملوءة بالحمض النووي الريبي الخالي من 70٪ الإيثانول. يجب أن يكون العمق كافيا لتغطية جميع الأقسام الموجودة على الشريحة عند غمر الشريحة.
بعد ذلك ضع حل 1٪ Azure B على نفس الحامل. لتقليل الوقت بين تغيير المحاليل أثناء الغسيل أو التلوين ، احتفظ بثلاث أو أربع مناديل مبللة أمام الرف لتصريف المحلول الإضافي بسرعة. عندما تصبح جاهزا ، أخرج الشرائح من الفريزر سالب 80 درجة مئوية وضعها على ثلج جاف قم بإذابة شريحة واحدة عن طريق وضعها على راحة يد مرتدية قفازات.
قم بإزالة معظم الرطوبة والتكثيف على الشريحة عن طريق مسحها بمنديل مختبر ، مع الحرص على عدم لمس الأقسام. ضع الشريحة على مجفف هلام السيليكا الطازج في طبق بتري لمدة 30 إلى 40 ثانية حتى يجف تماما. عندما يجف ، اغمس الشريحة في الأنبوب الأول من الحمض النووي الريبي ، خالية من 70٪ من الإيثانول.
انقع الشريحة لمدة 30 ثانية ثم اغسل OCT عن طريق غمسها لأعلى ولأسفل لمدة 45 ثانية إلى دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أخرج الشريحة من المحلول واستنزاف السائل الزائد على مناديل المختبر. كرر هذه العملية عن طريق غمس الشريحة في الأنبوب الثاني من 70٪ من الإيثانول.
إذا بقي OCT حول أقسام الحبل الشوكي ، كرر الغسيل في الأنبوب الثالث. بعد تصريف السائل الزائد ، اغمر الشريحة في محلول 1٪ Azure B في 70٪ RNAs ، وحرر الإيثانول لمدة 30 إلى 45 ثانية. استنزاف Azure B الزائد على مسحة معملية.
في هذه المرحلة ، ستكون الشريحة بأكملها زرقاء. اغمر الشريحة في الأنبوب التالي من 70٪ من الإيثانول واغمس لأعلى ولأسفل بسرعة ، ثلاث إلى أربع مرات لإزالة الصبغة الزائدة ولجعل تلطيخ الخلايا العصبية الحركية المحددة مرئيا. إذا بدت الأقسام ملطخة بشكل غامق للغاية ، كرر خطوة des تلطيخ في أنبوب جديد من 70٪ من الإيثانول.
إذا بدا التلوين خفيفا جدا ، فأعد الشريحة إلى محلول Azure B لمدة 32 أخرى وكرر التلوين. إذا كان التلوين مرضيا ، اترك الشريحة تجف في الهواء لفترة وجيزة وانتقل إلى الخطوة التالية. بعد تلطيخ DES وتجفيفه ، ستكون المادة الرمادية زرقاء فاتحة وستكون الخلايا العصبية الحركية الملونة باللون الأزرق الغامق مرئية بسهولة.
ابدأ التشريح مباشرة بعد تشغيل المجهر. قم بتفريغ حامل الأنبوب لتوصيل غطاء أنبوب fuge صغير 0.6 ملم. لجمع العينات ، ضع 30 ميكرولترا من محلول تحلل الغيني والثيوسيانات في الغطاء وقم بتغطية السطح عن طريق نشر المحلول.
باستخدام طرف الماصة، قم بمحاذاة الغطاء مع الفتحة والهدف. مع تآكل برنامج المجهر ، احتفظ بالغطاء في الوضع المغطى حتى بدء التقاط الليزر. ضع الشريحة المجففة بالهواء رأسا على عقب على مرحلة المجهر بحيث يكون جانب الغشاء متجها لأسفل ويكون القسم محاذاة مع الفتحة.
مع وضع الشريحة في مكانها ، ركز على قسم الحبل الشوكي مع هدف الخمسة x ثم انتقل إلى هدف 20 × للتشريح. أولا ، ضع علامة على منطقة وهمية بقلم الضوء واسمح لليزر بقطعها دون جمعها. هذا يريح الغشاء ويجعل من الممكن وضع علامات على مناطق متعددة وقطعها على التوالي.
بعد ذلك ، أعد التركيز وتحديد الخلايا العصبية الحركية في منطقة القرن البطني. يمكن التعرف على هذه الخلايا العصبية من خلال مورفولوجيا موقعها وحجمها الكبير والتلوين الأزرق الداكن باستخدام Azure B.باستخدام القلم الخفيف ، حدد أداة الرسم وقم بوضع علامة على طول حافة الخلايا العصبية الحركية لعمل مخطط كامل. حاول جعل المخطط التفصيلي أقرب ما يمكن إلى الخلايا العصبية الحركية لتجنب التلوث من الخلايا الأخرى.
يمكن تمييز خلايا متعددة قبل القطع لأن البرنامج سيتذكر المواضع عندما يكون جاهزا للقطع ، وقم بإحضار الغطاء أسفل موضع القطع والنقر فوق زر البدء لبدء تشريح الخلايا العصبية الحركية بالليزر. اجمع كل الخلايا العصبية الحركية من جميع الأقسام الموجودة في شريحة واحدة في غطاء أنبوب فوج صغير واحد. بعد اكتمال التجميع ، أخرج أنبوب fuge الصغير من الحامل عن طريق تفريغ الدرج وإزاحة الأنبوب برفق ، وإذابة الخلايا العصبية الحركية تماما والتخزين المؤقت عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل.
انقل المحلول إلى جسم الأنبوب عن طريق الطرد المركزي ، وقم بتجميد العينة على الفور في الثلج الجاف وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية بعد تلطيخها باستخدام Azure B. تظهر الخلايا العصبية الحركية كأجسام خلايا كبيرة ملطخة داكنة. يتم تأكيدها بواسطة الأجسام المضادة ل CHATT ، والتلطيخ ويمكن تمييزها بسهولة عن الخلايا المجاورة الأصغر. في هذا المثال ، تم تحديد أجسام الخلايا العصبية الحركية باستخدام القلم الخفيف وترقيمها بواسطة البرنامج.
هنا تم قطع أجسام الخلايا بالليزر وإسقاطها في أنبوب التجميع مع إيقاف تشغيل الخطوط العريضة. مدى تلف الليزر للمناطق المجاورة واضح. تظهر هنا النتائج النموذجية للتحليل الكهربائي لسلامة الحمض النووي الريبي لعينة من حوالي 4000 جسم خلية عصبية حركية للفأر تم جمعها بواسطة LMD.
لاحظ قمم الحمض النووي الريبي الريبوسومي البارزة. يجب أن تكتمل هذه العملية من تلطيخ الشرائح من خلال تشريح الخلايا العصبية الحركية في غضون 30 دقيقة لجميع الأقسام الموجودة في شريحة واحدة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في أسرع وقت ممكن ، سواء في التشريح الأولي وتضمين الحبل ، وكذلك في الخطوات النهائية للتلوين والالتقاط بالليزر للخلايا العصبية الحركية.
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة طريقة لاستعادة الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي للفئران باستخدام تقنية التشذيب المجهري بالليزر. يضمن هذا الإجراء الحد الأدنى من التلوث من الخلايا المجاورة، مما يمكن من تحليل الحمض النووي الريبي الدقيق.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا الجزيئية
- تحليل التعبير الجيني
الخلفية
- الخلايا العصبية الحركية حاسمة لفهم الأمراض التنكسية العصبية.
- استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة ضروري لدراسات التعبير الجيني الدقيقة.
- يمكن للتلوث من الخلايا المحيطة أن يؤدي إلى نتائج ملتوية.
- توفر تقنية التشذيب المجهري بالليزر حلاً لعزلة أنواع معينة من الخلايا.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة موثوقة لعزلة الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية الحركية.
- لمقارنة نسخ الحمض النووي الريبي بين الحيوانات الطافرة والحيوانات من النوع البري.
- للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء الاستخراج والتحليل.
الطرق المستخدمة
- تم تضمین أقسام الحبل الشوكي في وسط التضمين بالتبريد وتجميدها.
- تم تلوين الأقسام بـ Azure B وغسلها في الإيثانول.
- تم إجراء التشذيب المجهري بالليزر لعزلة الخلايا العصبية الحركية.
- تم تحضير الحمض النووي الريبي الكلي من المستحلبات لتحليلات التدفق السفلي.
النتائج الرئيسية
- تم استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة (حوالي 40-60 نانوجرام) بنجاح من 3,000-4,000 خلية عصبية حركية.
- لقد قامت الطريقة بتقليل التلوث من أنواع الخلايا الأخرى.
- تم الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي طوال الإجراء.
- يمكن إجراء تحليلات التدفق السفلي مثل RNA-seq و qRT-PCR.
الاستنتاجات
- الطريقة المطورة فعالة في عزل الحمض النووي الريبي من أنواع معينة من الخلايا العصبية.
- تتيح إمكانية إجراء دراسات مقارنة بين الخلايا العصبية المريضة والخلايا العصبية الطبيعية.
- يمكن لهذه التقنية أن تعزز فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية الحركية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolating high-integrity RNA from rare cell populations like motor neurons enables precise target validation in neurodegenerative disease models. This approach reduces biological noise and improves predictive confidence when comparing mutant versus wild-type transcriptional profiles. It supports early de-risking of therapeutic hypotheses by linking genotype to cell-type-specific gene expression changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant motor neurons without confounding signals from glial or neighboring cells.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate <10% of spinal cord cell population for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cell-type-specific RNA expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates qualified RNA inputs for downstream assays like qRT-PCR and RNA-seq with minimal cross-cell contamination.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through Azure B staining in 70% ethanol and direct lysis in guanidine thiocyanate buffer.
- Assay Readiness: Enables scalable profiling of motor neuron transcriptomes across genetic models or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by allowing direct comparison of RNA profiles between diseased and normal motor neurons.
- Operational Value: Maintains RNA integrity from sectioning through lysis, enabling reliable detection of transcriptional differences.
- Risk Mitigation: Reduces false positives in target validation by isolating the cellular source of signal.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing purified molecular readouts from disease-relevant neurons.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by isolating motor neuron-specific transcriptional responses.
- Screening: Produces assay-ready RNA with quantified integrity for consistent compound screening in neuronal models.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA yield, RIN values) that enable statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validity through direct comparison of mutant and wild-type neuron transcriptomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for isolating rare neuronal populations across multiple CNS targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized staining, laser capture, and lysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner, more interpretable transcriptional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on cell-type-specific expression changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, laser capture microdissection, and RNA handling to prevent degradation.
- Dependent on cryostat, UV laser microdissection system, and RNase-free reagents for consistent performance.
- Necessitates cross-team standardization of staining timing and ethanol wash steps to ensure motor neuron visibility.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to other neuronal subtypes or disease models.
- Limited by RNA yield scaling; best suited for pooled samples from multiple sections or animals.
