إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص حمض RNA عالي الجودة من العصبونات الحركية في الحبل الشوكي دون تلوث بـ RNA من الخلايا المجاورة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استعادة الحبل الشوكي وتقسيمه ثم تضمينه في وسط تضمين تجميدي وتجميده عند درجة حرارة -160 °C. وتتمثل الخطوة الثانية في إجراء قطاعات تجميدية للحبل الشوكي على شرائح غشاء البن عند درجة حرارة -20 °C.

بعد ذلك، تُغسل الشرائح في 70%ethanol وتُصبغ بـ Azure B في 70%ethanol. والخطوة النهائية هي استخدام التشريح المجهري بالتقاط الليزر (laser capture micro dissection) لعزل أجسام الخلايا العصبية الحركية المحددة في محلول guine thiocyanate lysis buffer. وفي النهاية، يتم تحضير RNA الكلي من نواتج التحلل المجمعة واختباره للكشف عن الاختلافات في نسخ RNA العام أو النوعي في الخلايا العصبية للحيوانات الطافرة مقابل الحيوانات البرية.

يتيح التشريح الدقيق بالتقاط الليزر استعادة أجسام الخلايا العصبية الحركية من مقاطع النخاع الشوكي دون تلوث بخلايا Scalia الأكثر عدداً أو أنواع الخلايا الأخرى. مما يمنح فرصة لتحضير الـ RNA ومقارنة النسخ بين الخلايا العصبية من حيوان مصاب وآخر سليم. وكان الجانب الأكثر صعوبة في تطوير هذا الإجراء هو إيجاد طريقة صبغ تسمح لنا بالكشف عن الخلايا العصبية الحركية في مقاطع النخاع الشوكي مع الحفاظ على مستويات عالية من سلامة الـ RNA وقابلية استخلاصه، وذلك قبل وأثناء عملية الالتقاط بالليزر.

وجدنا أن صبغ المقاطع باستخدام Azure B وإيثانول بتركيز 70% قد استوفى هذه المعايير عند دمجه مع جمع أجسام الخلايا المستأصلة مباشرة في محلول Guine Thiocyanate lysis Buffer، مما أثبت كفاءة هذا الإجراء الذي نفذه فان باديا، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا. وللحصول على أفضل النتائج، تأكد من تنظيف جميع المعدات بمحلول إزالة تلوث RNA، يليه إيثانول بتركيز 70% خالٍ من RNA. بعد القتل الرحيم والتروية القلبية العكسية، قم بعزل الحبل الشوكي بعناية. ثم اشطف الحبل الشوكي لمدة 10 ثوانٍ في محلول RNAs.

استخدم الماء المقطر لغسل أي بقايا دم، ثم ضع العينة على شريحة زجاجية خالية من الـ RNAs برفق شديد ولكن بسرعة. بعد ذلك، قم بتقسيم الحبل الشوكي عرضياً باستخدام شفرة حلاقة نظيفة إلى تسع أو عشر قطع. ضع القطع في قالب تجميد (cryo mold) مملوء بمركب OCT وقم بمحاذاتها عمودياً باستخدام إبرة نظيفة.

ضع القالب في صينية ضحلة تحتوي على ميثيل بوتان مبرد مسبقاً باستخدام النيتروجين السائل. ولتجنب تحلل الـ RNA، ضع الصينية في حمام من النيتروجين السائل؛ وذلك لتجميد قطع الحبل الشوكي بسرعة.

يُحفظ القالب المضمن في مركب OCT عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر قبل عملية التقطيع. وعندما يحين وقت التقطيع، يوضع القالب المضمن في مركب OCT داخل جهاز ميكروتوم تجميدي (cryostat) مبرد. يتم إنتاج شرائح بسمك 20 ميكرون تحتوي كل منها على 9 إلى 10 مقاطع عرضية للنخاع الشوكي.

ضع المقاطع على غشاء حامل شرائح خالٍ من الـ RNAs. تُحفظ شرائح الميكرونين في البداية في درجة حرارة الغرفة لضمان التصاق المقاطع. بعد ذلك مباشرة، أعد تجميد المقطع على سطح بدرجة حرارة -20 °C داخل الميكروتوم المجمد (cryostat).

تُحفظ الشرائح عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى وقت الاستخدام على حامل نظيف. يتم تحضير ست أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter مليء بإيثانول 70% الخالي من الـ RNAs. يجب أن يكون العمق كافياً لتغطية جميع المقاطع الموجودة على الشريحة عند غمرها.

ضع بعد ذلك محلول Azure B بتركيز 1% على نفس الحامل. ولتقليل الوقت المستغرق بين تغيير المحاليل أثناء الغسيل أو الصبغ، ضع ثلاث أو أربع من المناديل المخبرية أمام الحامل لتصريف المحلول الزائد بسرعة. وعندما تكون مستعداً، أخرج الشرائح من المجمد ذو درجة الحرارة -80 °C وضعها على الثلج الجاف، ثم قم بإذابة الشريحة عن طريق وضعها على راحة يد ترتدي قفازاً.

قم بإزالة معظم الرطوبة والتكثف عن الشريحة بمسحها باستخدام منديل مختبري، مع الحرص على عدم لمس المقاطع. ضع الشريحة فوق هلام السيليكا المجفف الجديد في طبق بتري لمدة 30 إلى 40 ثانية لتجف تماماً. وعندما تجف، اغمس الشريحة في الأنبوب الأول من الإيثانول 70% الخالي من الـ RNAs.

انقع الشريحة لمدة 30 ثانية، ثم اغسل مادة OCT عن طريق غمرها للأعلى وللأسفل لمدة تتراوح بين 45 ثانية ودقيقة واحدة. بعد ذلك، أخرج الشريحة من المحلول وجفف السائل الزائد باستخدام مناديل مختبرية. كرر هذه العملية بغمر الشريحة في الأنبوب الثاني الذي يحتوي على 70%ethanol.

إذا ظل مركب OCT حول مقاطع النخاع الشوكي، كرر عملية الغسيل في الأنبوب الثالث. بعد تصريف السائل الزائد، اغمر الشريحة في محلول Azure B بتركيز 1% في إيثانول 70% خالي من الـ RNases لمدة تتراوح من 30 إلى 45 ثانية. ثم جفف فائض Azure B باستخدام منديل مختبري.

في هذه المرحلة، ستظهر الشريحة بأكملها باللون الأزرق. اغمر الشريحة في الأنبوب التالي الذي يحتوي على ethanol 70% وحركها للأعلى وللأسفل بسرعة من ثلاث إلى أربع مرات لإزالة الصبغة الزائدة ولجعل صبغ العصبونات الحركية المحددة مرئياً. إذا بدت المقاطع مصبوغة بلون داكن جداً، كرر خطوة إزالة الصبغة في أنبوب جديد من ethanol 70%.

إذا بدا التلوين باهتًا جدًا، أعد الشريحة إلى محلول Azure B لمدة 32 ثانية أخرى وكرر عملية تلوين DES. أما إذا كان التلوين مرضِيًا، فاترك الشريحة لتجف في الهواء لفترة وجيزة ثم انتقل إلى الخطوة التالية. بعد تلوين DES والتجفيف، ستظهر المادة الرمادية باللون الأزرق الفاتح، بينما ستكون العصبونات الحركية المصبوغة باللون الأزرق الداكن مرئية بوضوح.

ابدأ عملية التشريح فور تشغيل المجهر. قم بتفريغ حامل الأنبوب لتثبيت غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم 0.6 millimeter. ولجمع العينة، ضع 30 µL من محلول guine and thiocyanate lysis buffer في الغطاء وقم بتغطية السطح عن طريق توزيع المحلول.

باستخدام طرف ماصة، قم بمحاذاة الغطاء مع الفتحة والعدسة الشيئية. وباستخدام برنامج المجهر، حافظ على الغطاء في وضع الإغلاق حتى بدء عملية الالتقاط بالليزر. ضع الشريحة المجففة هوائياً مقلوبة على منصة المجهر بحيث يكون جانب الغشاء متجهاً للأسفل ويكون المقطع محاذياً للفتحة.

بعد وضع الشريحة في مكانها، قم بضبط التركيز على مقطع من الحبل الشوكي باستخدام العدسة الشيئية 5x، ثم انتقل إلى العدسة الشيئية 20x لإجراء التشريح. أولاً، حدد منطقة وهمية باستخدام القلم الضوئي واترك الليزر يقطعها دون جمعها؛ حيث يؤدي ذلك إلى إرخاء الغشاء، مما يتيح إمكانية تحديد وقطع مناطق متعددة على التوالي.

بعد ذلك، أعد ضبط التركيز وحدد العصبونات الحركية في منطقة القرن البطني. يمكن التعرف على هذه العصبونات من خلال موقعها وشكلها، وحجمها الكبير، وتلونها باللون الأزرق الداكن باستخدام صبغة Azure B. باستخدام القلم الضوئي، اختر أداة الرسم وقم بالتحديد على طول حافة العصبونات الحركية لرسم مخطط كامل. حاول جعل المخطط دقيقاً قدر الإمكان حول العصبون الحركي لتجنب التداخل مع الخلايا الأخرى.

يمكن تحديد عدة خلايا قبل البدء في عملية القطع، حيث سيحتفظ البرنامج بمواقعها؛ وعندما تصبح جاهزاً للقطع، ضع الغطاء أسفل موضع القطع وانقر فوق زر البدء لبدء عملية تشريح العصبونات الحركية باستخدام الليزر. اجمع كافة العصبونات الحركية من جميع المقاطع الموجودة على شريحة واحدة في غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق واحد. بعد اكتمال عملية الجمع، أخرج أنبوب الطرد المركزي الدقيق من الحامل عن طريق تفريغ الصينية وإزاحة الأنبوب برفق، ثم قم بإذابة العصبونات الحركية والمحلول المنظم تماماً عن طريق سحب المحلول ودفعه للأعلى والأسفل باستخدام الماصة.

انقل المحلول إلى جسم الأنبوب عن طريق الطرد المركزي، ثم جمد العينة فوراً في الثلج الجاف واحفظها في درجة حرارة 80- درجة مئوية بعد التلوين بصبغة Azure B. تظهر العصبونات الحركية على شكل أجسام خلوية كبيرة داكنة التلوين، ويتم تأكيدها من خلال التلوين بالأجسام المضادة anti CHATT، كما يمكن تمييزها بسهولة عن الخلايا المجاورة الأصغر حجماً. في هذا المثال، تم تحديد محيط أجسام العصبونات الحركية باستخدام القلم الضوئي وترقيمها بواسطة البرنامج.

هنا تم استئصال أجسام الخلايا باستخدام الليزر وإسقاطها في أنبوب الجمع مع إيقاف تشغيل الخطوط المحددة. ويظهر هنا مدى الضرر الناتج عن الليزر في المناطق المجاورة. وتُعرض هنا النتائج النموذجية لتحليل الرحلان الكهربائي لسلامة الـ RNA لعينة مكونة من ما يقرب من 4,000 من أجسام الخلايا العصبية الحركية للفأر التي تم جمعها بواسطة LMD.

لاحظ قمم الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (ribosomal RNA) البارزة. يجب إكمال هذه العملية، بدءاً من صبغ الشريحة وصولاً إلى تشريح العصبونات الحركية، في غضون 30 دقيقة لجميع المقاطع الموجودة على شريحة واحدة لتقليل تحلل RNA إلى أدنى حد. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بأسرع ما يمكن، سواء في مرحلة التشريح الأولي وتضمين الحبل الشوكي، أو في الخطوات النهائية من الصبغ والتشريح الدقيق بالتقاط الليزر للعصبونات الحركية.