العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتنقية مجموعات فرعية من الخلايا السلفية متعددة القدرات المشتقة من الأوعية الدموية البشرية من خزعة واحدة للعضلات الهيكلية، وذلك من خلال تفكيك خزعة العضلة أولاً وهضمها بمزيج من الكولاجيناز من النوع الأول والثاني والرابع. ثم يتم وسم معلق الخلايا المفردة بأجسام مضادة مقترنة بفلورسنت تتعرف على مجموعة مختارة من علامات سطح الخلية. بعد ذلك، يتم إجراء فرز الخلايا المفعل بالفلورسنت عن طريق قياس التدفق الخلوي.

يمكن معاينة وتوسيع الأنواع الفرعية للخلايا المفرزة في ظروف استنبات محددة وبكثافات مثالية. وفي نهاية المطاف، يُستخدم تحليل ما بعد الفرز للخلايا المنقاة، بالإضافة إلى تحليل قياس التدفق الخلوي و R-T-P-C-R اللاحق للمجموعات الفرعية للخلايا المستنبتة، لإظهار نقاء هذه المجموعات المتجانسة من BVSE. نعم، يمكن لهذه الطريقة أن تجيب حقاً على سؤال: ما هو أصل خلايا الجذعية الميزنكيمية في الإبل؟

كما تعلم، فقد وجد الكثير من الناس أنواعًا مختلفة من الخلايا الجذعية في أنسجة مختلفة. لذا أعتقد أن هذا يمكن أن يجيب على تساؤلات حول أصل تلك الخلايا الجذعية، بالإضافة إلى الدور الذي تلعبه الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية وأي خلايا أخرى مشتقة من الأوعية الدموية في تجديد الأنسجة وإصلاحها. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية نظرًا لطبيعة خزعة العضلات.

يمكن أن تكون خطوات الفصل صعبة التعلم. وتعد التفاصيل التقنية وتحسين عملية الهضم باستخدام الكولاجيناز (collagenase) بالغة الأهمية لضمان إنتاجية وتنقية الخلايا المستهدفة. ينقل خزعة العضلة الهيكلية البشرية على الثلج.

في وسط DM M مكمل بـ 5%FBS و1%penicillin streptomycin تحت ظروف معقمة. اغسل العينة مرتين باستخدام PBS يحتوي على 2%antibiotic antifungal ثم في dms مكمل بـ 2%aa. قم بإزالة الأنسجة الدهنية والضامة الملتصقة.

قم أيضاً بإزالة الأوعية الدموية الكبيرة باستخدام مجهر التشريح. الآن، قطع عينة العضلات إلى قطع صغيرة. انقل العينات إلى 20 milliliters من وسط الحفظ للتخزين عند درجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة تصل إلى خمسة أيام.

في يوم عزل الخلايا، قم بإزالة قطع العضلات وغسلها مرتين في PBS يحتوي على 2% pen strip. ولتحضير محلول الهضم، أضف 100 mg/mL من كل من collagenase النوع الأول والنوع الثاني والنوع الرابع إلى pm.

أخيراً، قم بتقطيع وفرم قطع العضلات ميكانيكياً مع كمية صغيرة من pm. مرر المحلول عبر ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliter مع مراقبة خلوه من التجلط. قم بإزالة بقايا الأنسجة الدهنية والضامة خلال هذه العملية.

بعد ذلك، انقل نصف عينة البالغين إلى 20 milliliters أو كامل عينة الجنين إلى 10 milliliters من محلول الهضم. قم بهضم العينة لمدة 50 إلى 60 دقيقة عند 37 degrees Celsius على هزاز مداري بسرعة 70 إلى 80 RPM. راقب حالة الهضم كل 15 إلى 20 دقيقة.

قم بتحسين إنتاجية الخلايا والحفاظ على المستضدات السطحية من خلال ضبط وقت الهضم و/أو سرعة التحريك وفقاً لذلك، بناءً على كمية النسيج؛ وعندما تصفو العكارة تقريباً، قم بسحب النسيج المهضوم بالماصة بقوة من ثلاث إلى خمس مرات. أضف كمية مساوية من PM لإيقاف التفاعل، ثم قم بالطرد المركزي عند 400 Gs لمدة أربع دقائق، وأزل السائل الطافي بعناية لغسل الراسب ثم أعد تعليقه في 10 milliliters من pm. قم بالترشيح عبر مصفاة خلايا بمقاس 100 micron، ثم أجرِ عملية الطرد المركزي عند 400 Gs لمدة أربع دقائق، وأزل السائل الطافي بعناية.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الرواسب في منظم تحلل الكريات الحمراء وقم بترشيحها عبر مصفاة خلايا بمسام 70 micron للحصول على معلق خلوي أحادي. وبعد التحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، قم بترشيح المعلق عبر مصفاة خلايا بمسام 70 micrometer. وفي حالة ملاحظة أي ترسب، قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة التعليق.

قم بالتعليق في 0.5 milliliters من PBS وعدّ عدد الخلايا المخصصة للتلوين. خفف معلق الخلايا المفردة إلى أقل من 5 million cells per milliliter باستخدام PBS، ثم خذ كمية 50 إلى 100 microliters من معلق الخلايا ووزعها على 11 أنبوباً مخصصة لعينة الضبط غير الملونة، وعينات الضبط السلبية، وعينات الضبط الإيجابية أحادية اللون. إذا لزم الأمر، قم بحجب معلق الخلايا المفردة لمدة 10 minutes عند درجة حرارة 4 °C في مصل الفئران.

أضف محاليل الأجسام المضادة وفقاً للتصميم التجريبي واتركها لتحضن لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي واغسل كل راسب عينة مرة واحدة في PM مخفف بتركيز نهائي يبلغ 5 ملايين خلية لكل milliliter لاستبعاد الخلايا الميتة بتخفيف 1 إلى 100 من seven a a d، واتركها لتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بالنسبة للضابط السلبي وضوابط اللون الواحد الإيجابية. أعد تعليق رواسب الخلايا في 0.5 milliliter من pm المخفف.

انقل جميع معلقات الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المصنوعة من البوليسترين ذات القاع المستدير. الآن، قم بتجهيز أنابيب جمع الخلايا بوضع 500 µL من وسط coer المناسب. انقل معلقات الخلايا على الثلج إلى الخلية.

قم بتشغيل عمليات فرز معلقات الخلايا على جهاز فرز الخلايا وفق الترتيب التالي: الضوابط السالبة غير المصبوغة، ثم الضوابط الموجبة أحادية اللون، ثم معلق الخلايا الرئيسي، مع ضبط شدة الليزر، وتعويض القنوات، وتحديد بوابات مجموعات الخلايا بدقة لزيادة نقاء الخلايا إلى أقصى حد. اجمع مجموعات الخلايا المطلوبة في أنابيب الجمع المناسبة. احفظ الخلايا المجمعة عند درجة حرارة 4 °C.

في حال عدم إجراء الاستزراع على الفور، يتم استزراع الخلايا البطانية العضلية التي تم فرزها حديثاً في وسط MPM على أطباق تم ترميزها مسبقاً بكولاجين من النوع الأول (Type one collagen) من أجل التغليف اللاحق لـ ECS seed.

من 3,500 إلى 4,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط MPM على أطباق أو دوارق مطلية مسبقاً بكولاجين النوع الأول. يتم استزراع الطفيليات التي تم فرزها حديثاً في وسط egm two على أطباق مطلية حديثاً بـ 0.2% جيلاتين للمرور الأول والثاني. يتم تقسيم الخلايا بنسبة 1 إلى 3 في وسط PC على مزارع بولي ستيرين عادية.

الأطباق بدءاً من الممر الثالث (P3) فصاعداً. يتم استزراع الخلايا بكثافة تتراوح من 6,500 إلى 7,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط PC على أطباق استزراع بوليسترين عادية. وبالنسبة للدوارق، يتم استزراع خلايا النسيج المغامر (advent tissue cells) التي تم فرزها حديثاً في وسط AC على أطباق استزراع بوليسترين عادية، وذلك للتعبئة اللاحقة لخلايا ACS البذرية بكثافة تتراوح من 6,000 إلى 7,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط AC على أطباق استزراع بوليسترين عادية.

يتم أولاً تصحيح معايير حقائق القارورات بناءً على البيانات التي تم الحصول عليها من الضابط غير المصبوغ، والضوابط السلبية، والضوابط الإيجابية أحادية اللون بعد استبعاد الخلايا الميتة، ثم تخضع معلق الخلايا المصبوغة فلوريسنتياً لسلسلة من عمليات اختيار علامات سطح الخلية السلبية والإيجابية. أولاً، يتم استبعاد الخلايا الإيجابية لـ CD 45. بعد ذلك، يتم فصل الخلايا الإيجابية لـ CD 56 والخلايا السلبية لـ CD 56 من الجزء السلبي لـ CD 45.

يخضع الجزء الموجب لـ CD 56 لاحقاً لعملية اختيار لـ CD 34 وCD 1 44، حيث يتم تمييز الخلايا الموجبة لكليهما فقط على أنها خلايا بطانية عضلية ثم يتم جمعها. وبالمثل، يخضع الجزء السالب لـ CD 56 لعملية اختيار لـ CD 34 وCD 1 46، حيث يتم تمييز الخلايا السالبة لـ CD 34 والموجبة لـ CD 1 46 فقط على أنها طفيليات ثم يتم جمعها؛ أما الجزء الموجب لـ CD 34 والسالب لـ CD 1 46 فيخضع لاختيار سلبي إضافي لـ CD 31 لاستبعاد الخلايا البطانية، ويتم تمييز المجموعة الفرعية الموجبة لـ CD 34 والسالبة لـ CD 31 فقط على أنها خلايا adv لجمعها. وهنا، يمكن استخدام CD 1 44 كبديل لـ CD 31 لاستبعاد EC.

تم تنقية هذه المجموعات الفرعية من الخلايا الجذعية المستمدة من الأوعية الدموية البشرية (H-P-V-S-C) من خزعات عضلية لمانح واحد. وعلى عكس الخلايا الجذعية العضلية غير المتجانسة النموذجية، تظل مزارع المجموعات الفرعية للخلايا الجذعية المستمدة من الأوعية الدموية البشرية متجانسة حتى بعد التوسع طويل الأمد. وكما تعلمون، أعتقد أنه من المهم جداً للباحثين في هذا المجال استخدام التقنية نفسها لعزل تلك الخلايا الجذعية المستمدة من الأوعية الدموية التي وصفناها في مختبراتنا.

لذا، نعتقد أن هذه التقنية، وبطريقة المقارنة جنباً إلى جنب، ستسمح للباحثين بإعادة إنتاج نتائجنا ومقارنة النتائج بين فريق وآخر بشكل فعلي. لا تنسوا أن العمل مع الأنسجة البشرية الطازجة يمكن أن يكون خطيراً للغاية؛ لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء قفازات النيتريل وواقي العينين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.