DNBS / TNBS التهاب القولون نماذج: توفير نظرة ثاقبة مرض التهاب الأمعاء وآثار الدهون الغذائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم طريقة بديلة وغير مكلفة لدراسة مرض التهاب الأمعاء أو IBD باستخدام حمض DNBS (2,4-dinitrobenzene sulfonic acid). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إعطاء DNBS عبر المستقيم من خلال الإدخال اللطيف في فتحة الشرج. وفي الخطوة الثانية، يتم الحصول على مقاطع نسيجية من الأمعاء الغليظة للفحص النسيجي وتقييم نشاط myelo peroxidase في الأنسجة التي تعرضت لـ DNBS، وفي النهاية يمكن تقييم تأثيرات الزيوت الغذائية على فقدان الوزن والتهاب القولون باستخدام الطرق العيانية والمجهرية على حد سواء.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا الأمر مقارنة بطريقة كبريتات ديكستران الصوديوم الموجودة حالياً في أن طريقة DNBS سهلة التنفيذ، وأقل تكلفة، وعالية التكرارية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة محورية في مجال أبحاث IBD، مثل ما هي أدوار التوتر والاكتئاب في تكرار الإصابة بـ IBD، أو ما هي الآليات الكامنة في إصابة الأمعاء وترميمها. ولإجراء التثبيت المستقيمي لـ DNBS في الفئران، ابدأ بتوصيل حقنة سعة 1 mL بإبرة قياس 19 gauge. ثم قم بتجهيزها بقسطرة بولي إيثيلين 50، وبعد ذلك اسحب DNBS المحضر حديثاً إلى داخل القسطرة.

بعد ذلك، ضع جل الدموع على فأر مخدّر، ثم اضغط بلطف بأطراف الأصابع على الطرف الخلفي للحيوان لإزالة أي براز موجود في القولون distal colon. الآن، احقن كمية صغيرة من محلول DNBS لتزييت القولون لتسهيل عملية الإدخال، مع إدخال القسطرة بلطف عبر المستقيم لمسافة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات. وبمجرد استقرار القسطرة في مكانها، احقن 100 microliters من DNBS أو حجماً مساوياً من 50%ethanol للحيوانات الضابطة.

ثم ضع الحيوان في وضعية الرأس للأسفل لمدة 90 ثانية لتجنب فقدان الكواشف. بعد إعطاء DNBS، قم بتغذية الحيوانات بماء السكروز بتركيز 8% في محلول ملحي بتركيز 0.2% لمنع الجفاف خلال الأسبوع الأول. يجب مراقبة الحيوانات بعناية يومياً لرصد أي فقدان في الوزن أو جفاف أو إجهاد طوال مدة التجربة وصولاً إلى النقطة الزمنية المحددة.

بعد تحفيز DNBS، افتح التجويف البطني للحيوان الذي تم القتل الرحيم له واستأصل الأمعاء الغليظة بالكامل. ثم افتح الأمعاء طولياً. يجب ملاحظة وجود قرح مخاطية عيانية على بعد حوالي سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات من الطرف القاصي للقولون.

قم بجمع مقاطع بطول 0.5 سنتيمتر من المنطقة القريبة من موقع أقصى ضرر عياني في الحيوانات التجريبية، ومقاطع من القولون من المواقع التشريحية المقابلة في حيوانات المجموعة الضابطة. بعد ذلك، قم بتجميد سريع لمقاطع بطول 0.5 سنتيمتر من حيوان ضابط واحد ومقطع معالج بـ 1D NBS في النيتروجين السائل لتقييم نشاط myelo peroxidase، وثبّت المقاطع الأخرى في فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% طوال الليل من أجل التحليل النسيجي. وفي صباح اليوم التالي، اغسل الأنسجة المثبتة بالفورمالين بإيثانول بتركيز 70% وضعها في كاسيت لإرسالها إلى مرفق تحليل نسيجي لدمجها في البارافين وصبغها بـ hematin و eoin من أجل التقييم النسيجي.

بعد ذلك، يتم تقييم ما لا يقل عن ثلاثة مقاطع نسيجية من كل حيوان باستخدام المجهر الضوئي لتحديد درجات التلف النسيجي لكل مجموعة. ولقياس نشاط إنزيم myelo peroxidase في الأنسجة التي تعرضت لـ DNBS، يتم أولاً تجنيس الأنسجة الضابطة والتجريبية المجمدة سريعاً في محلول منظم لتجنيس myelo peroxidase، بحيث نحصل على معلق يحتوي على 50 milligram من قطعة القولون لكل milliliter من محلول التجنيس. ثم يتم تقسيم المحلول المجنس إلى أجزاء بحجم one milliliter وطردها مركزياً لمدة دقيقتين عند 10,000 ×g ودرجة حرارة four °C.

بعد ذلك، انقُل 100 µL من كل جزء إلى كوفيتات منفصلة وأضف 2.9 mL من محلول PBS المكمل بـ IDE وdihydrochloride وبيروكسيد الهيدروجين مع الخلط بقوة. وأخيراً، قِس معدل الامتصاص باستخدام جهاز المطياف الضوئي عند 460 nm. وذلك عقب التحفيز داخل المستقيم باستخدام DNBS كما تم توضيحه للتو.

يُلاحظ فقدان كبير في الوزن بحلول الساعة 48 في الجرذان التي تم تزويدها بزيت السمك أو زيت الكانولا، وبحلول الساعة 72 في الجرذان التي تم تزويدها بزيت العصفر. ويحدث أقصى فقدان للوزن تم رصده عند الساعة 48 في الجرذان المزوّدة بزيت السمك، وبحلول الساعة 72 في الجرذان المزوّدة بزيت الكانولا أو زيت العصفر.

استؤنفت زيادة الوزن بعد 72 ساعة، وبحلول اليوم الخامس بعد إعطاء DNBS، أظهرت المجموعات المعالجة بزيت السمك وزيت العصفر أوزانًا للجسم مماثلة لقيمها الأساسية. أما جرذان المجموعة الضابطة التي تلقت الزيوت الغذائية وتعرضت للإيثانول عن طريق المستقيم، فقد اكتسبت الوزن بشكل مطرد طوال فترة الدراسة التي استمرت خمسة أيام. يمكن أن يكون التلف المعوي الناجم عن DNBS واسع النطاق.

ومع ذلك، فإن منطقة الضرر القصوى تتركز بشكل عام في السنتيمترات الستة البعيدة من القولون في الجرذان، والسنتيمترات الثلاثة البعيدة في الفئران. وعند إجراء تقييم نسيجي دقيق، يُلاحظ وجود إصابة ظهارية واسعة النطاق، تشمل تكوين قرح، وتسلل الخلايا المتعادلة والخلايا اللمفاوية، ونضوب المخاط، ووذمة. وعلى الرغم من أن هذه العلامات النسيجية للالتهاب وتلف الأنسجة كانت واضحة في المجموعات الثلاث المكملة بالزيوت الغذائية عند التحفيز باستخدام DNBS، إلا أن الضرر الأكثر شدة لوحظ في مجموعة زيت العصفر، تليها مجموعة زيت الكانولا.

بينما تُظهر الجرذان في مجموعة زيت السمك أدنى حد من الإصابة الظهارية وتسللاً محدوداً للخلايا الالتهابية إلى الطبقة المخاطية تحت المخاطية. ويمكن قياس الاختلافات في التلف النسيجي بين العينات لإتاحة مقارنة أفضل بين المجموعات. يوضح الرسم البياني درجات التلف النسيجي لمجموعات الزيوت الغذائية الثلاث أثناء التهاب القولون الناجم عن DNBS.

كما هو ملاحظ في المقاطع المصبوغة بـ h and e، تظهر المجموعة التي تم تزويدها بزيت العصفر أكبر قدر من التلف، تليها مجموعة زيت الكانولا. وبينما تظهر مجموعة زيت السمك أقل قدر من التلف، يمكن فحص مدى تسلل الخلايا الالتهابية، لا سيما الخلايا المتعادلة، بشكل أكبر عن طريق إجراء مقايسة نشاط myelo peroxidase، وذلك كما هو متوقع من درجات التلف النسيجي.

يكشف تقييم نشاط المايلوبيروكسيداز في قولون الجرذان في اليوم الخامس بعد التعرض لـ DNBS عن زيادة في النشاط في المجموعات الثلاث جميعاً، حيث لوحظ أعلى نشاط للمايلوبيروكسيداز في مجموعة زيت العصفور، تليها مجموعة زيت الكانولا ثم مجموعة زيت السمك. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تخدير الفئران تخديراً خفيفاً وتحسين جرعات DNBS بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مرض الأمعاء الالتهابي لاستكشاف الآليات التي تتحكم في الالتهاب المعوي في النماذج الحيوانية لمرض IBD.

لا تنسَ أن العمل باستخدام DNBS قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً ارتداء احتياطات الوقاية مثل الملابس الواقية، والقفازات، والنظارات الواقية، وأقنعة الوجه أثناء تحضير المحلول.