فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية

الهدف العام من الإجراء التالي هو الحصول على صور فلورية فائقة الدقة توضح جوانب مهمة من تنظيم الحويصلات بدقة لا يمكن تحقيقها بخلاف ذلك باستخدام المجهر الفلوري. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترقيع العصبونات الحصينية بـ DNA يشفر هجائن قابلة للتحول الضوئي من حمولة الحويصلات. وفي الخطوة الثانية، يتم جمع صور أولية تم أخذ عينات منها بشكل متباعد باستخدام نظام المجهر فائق الدقة.

بعد ذلك، تتم معالجة الصور الخام لإنتاج صورة فائقة الدقة. وفي الخطوة النهائية، يتم قياس البيانات كمياً لتوضيح تنظيم الحويصلات. وفي النهاية، يمكن استخدام المخططات الخطية لشدة النقاط لمقارنة المسافة الفاصلة بين الحويصلات بعرض الحويصلة، وبالتالي تحديد ما إذا كانت الحويصلات متقاربة بما يكفي لتشكيل تجمع باستخدام هذا الإجراء.

يمكن استخدام مجهر التحديد الموضعي المنشط ضوئياً بلون واحد أو palm لدراسة تنظيم العضيات في معظم أنواع الخلايا المستزرعة. لبدء تشغيل نظام التصوير فائق الدقة من أجل الحصول على الصور، ابدأ بتشغيل الطاقة لمصباح القوس. بعد ذلك، قم بتشغيل مفاتيح جهاز الكمبيوتر الخاص بالنظام والمكونات الموجودة في جهاز التحكم عن بُعد للطاقة.

قم بتفعيل مفتاح التشغيل بعد أن يبدأ جهاز التحكم اللوحي للمجهر في العمل، ثم قم بتشغيل الكمبيوتر وتشغيل البرنامج. قم بتوسيع نافذة حالة الإقلاع للتحقق من أن النظام يتم تحميله بشكل طبيعي، واختر خيار بدء النظام في مربع حوار تسجيل الدخول. لتحديد موضع العينة من أجل التصور، افتح اللوحات الأمامية والعلوية في خزانة السلامة الليزرية وأمل ذراع الضوء النافذ للوصول إلى المنصة والعدسات الشيئية.

بعد ذلك، ضع الزيت على عدسة alpha plan APO Chromat 100 x ذات الانعكاس الداخلي الكلي، أو الفلورية، أو عدسة turf. ثم اختر عدسة ذات تكبير منخفض لخطوة التركيز الأولية. والآن، ثبّت العينة على المنصة وارفع العدسة باتجاه العينة.

مراقبة موضع العدسة باستخدام وظيفة X, Y, Z في الجهاز اللوحي للتحكم. التوقف عندما تكون العدسة في النطاق التقريبي للتركيز. لمعاينة العينة وضبط التركيز بدقة.

اخفض ذراع الإضاءة وأغلق ألواح الوصول تماماً. ثم في علامة تبويب التحديد (locate)، انقر على رمز تمديد العينية لإظهار مخطط لمسار الضوء، واختر وضع النقل (trans on) وتحقق من أن المخطط يظهر الضوء النافذ من المصباح وهو يسقط على العينة. انظر عبر العدسات العينية وقم بضبط بؤرة الخلايا باستخدام الجهاز اللوحي للتحكم كدليل.

بعد ذلك، ولتحديد الخلايا التي تعبر عن DRA two، اختر الضوء المنعكس والمرشح المناسب لرؤية الانبعاث الأخضر من den two. قم بمسح غطاء الشريحة باستخدام ضوء منعكس منخفض الكثافة حتى يتم العثور على خلية ساطعة وسليمة، ومن ثم قم بإعداد البرنامج للحصول على بيانات palm. انتقل إلى علامة تبويب الحصول على البيانات (acquisition)، واستخدم مدير التجربة لتحميل تكوين الحصول على بيانات palm التجريبي المناسب.

عندما تظهر القائمة المنبثقة التي تستفسر عن تشغيل الليزرات، انقر على "نعم"، ثم قم بضبط بؤرة صورة الخلية عند مستوى الكاميرا. اختر مسار 488 فقط. اضبط معاملات الاستحواذ مثل كسب E-M-C-C-D، ثم اختر الاستحواذ المستمر.

بعد ذلك، قم بضبط الشاشة على مستوى السطوع المطلوب وحرّك الشيئية حتى تصبح الصورة على الشاشة واضحة. ثم لالتقاط صورة تقليدية بمجال واسع، انقر فوق زر snap واحفظ الصورة. لإعداد الإضاءة المستندة إلى turf على مسار 488، اختر turf في زر epi turf.

لتحسين الإضاءة القائمة على تقنية turf، اختر الاستحواذ المستمر وقم بتعديل زاوية إضاءة turf حتى تصبح الخلفية داكنة فجأة ويصبح من الممكن تركيز العينة في مستوى واحد فقط. انتقل إلى مسار 561 مع إيقاف تشغيل ليزر 405 nanometer. اضبط كسب E-M-C-C-D عند حوالي 200 ووقت التعرض عند حوالي 50 milliseconds.

اختر مرشح الانبعاث الذي يسمح بمرور الضوء الأحمر، واضبط شدة الليزر عند حوالي 40%. تحقق مرة أخرى من زاوية الـ turf للمسار 561. ولتقليل الخلفية، قم بإضاءة العينة حتى تتلاشى الخلفية. استخدم المسار 561 مع تفعيل ليزر 561 فقط.

لجمع بيانات الـ palm، قم بتشغيل ليزر 405 nanometer للمسار 561 واضبط شدة ليزر 405 إلى حوالي 0.01% لمراقبة صورة الـ palm المحسوبة أثناء عملية الاستحواذ، قم بتوسيع قائمة خيارات المعالجة المباشرة (online processing) وحدد خيار online processing palm للمعالجة باستخدام المعلمات الافتراضية. انقر على start experiment لبدء الاستحواذ وأثناء جمع البيانات، راقب عملية التحويل الضوئي بصرياً، مع زيادة شدة ليزر التحويل الضوئي 405 nanometer. عندما يبدأ التحويل الضوئي لـ denture two في التضاؤل.

عندما لا يعود التحويل الضوئي يزداد بعد زيادة شدة الليزر، انقر فوق إنهاء الخطوة الحالية. لإنهاء التجربة، قم بحفظ الملف. لمعالجة الصور المحفوظة، انقر فوق علامة تبويب المعالجة، ووسع قائمة الطريقة، ثم وسع القائمة الفرعية palm.

اختر palm مرة أخرى من الخيارات الفرعية الأربعة. حدد الصورة المناسبة بحيث تظهر في نافذة العرض. قم بتوسيع معلمات الطريقة وانقر على select لإدخال الصورة، ثم قم بتوسيع حقل الإعدادات واختر default لتنفيذ عملية إيجاد القمم وتحديد المواقع باستخدام الخيارات الافتراضية.

اضغط على "تطبيق" (apply) في علامة تبويب المعالجة لحساب صورة PALM، والتي ستظهر في علامة تبويب منفصلة في نافذة العرض لتصفية أي مكونات تم أخذ عيناتها بشكل ضعيف في البيانات. استخدم نظرية نايكويست لأخذ العينات وأداة إزالة القيم المتطرفة في PALM لحذف القمم في المناطق التي تكون فيها المسافة المتوسطة بين القمم، d، كبيرة جداً بحيث لا يمكن تحليل حويصلة بقطر D. مع وجود صورة PALM في نافذة العرض، انقر على "تحديد" (select) لإدخال الصورة ثم انقر على "تطبيق" (apply). ستظهر الصورة الجديدة في علامة تبويب منفصلة في نافذة العرض لتصفية أي جزيئات تم تحديد موقعها بشكل ضعيف.

انتقل إلى علامة تبويب تصفية PAL، وحدد النباتات المقبولة. حدد أربع دقات تموضع بقيمة sigma أقل من 35 nanometers. لاختيار وضع عرض لصورة PAL، انتقل إلى علامة تبويب صيرورة PAL، وحدد دقة البكسل ووضع العرض المطلوب.

في هذه الصورة، يظهر المنتج النهائي النموذجي لتقنية palm الناتجة عن تصوير ومعالجة حويصلة لب كثيفة عصبونية أو DCV باللون الأحمر. وتظهر الإحداثيات الجانبية لـ flora fours الموضعية باللون الأبيض باستخدام وضع عرض Centro، بينما تظهر صورة الدقة الفائقة للحويصلة المرتبطة باستخدام وضع عرض Gaussian. وفي هذا الشكل الثاني، يتم عرض صور مماثلة للمجال الواسع باللون الأخضر وصور palm باللون الأحمر لجسم الخلية والزوائد القريبة لعصبون حصيني تم استنباته مختبريًا لمدة ثمانية أيام ويعبر عن tpa, a danger two.

تشمل السمات الهامة للصور التطابق الواسع بنسبة واحد إلى واحد والتداخل باللون الأصفر بين النقاط (puncta) وصور المجهر التقليدية وصور الـ palm. كما يظهر الحجم الأصغر بكثير لنقاط الـ palm، والقدرة أحياناً على تحليل نقطة واحدة من صور المجهر ذو المجال الواسع (widefield) إلى نقاط palm متعددة. تظهر هنا صورة palm لـ D cvs على طول جزء من استطالة عصبون حُصيني ثانٍ يعبر عن tpa.

يظهر الشكل DENDRA two. لاحظ القطر الصغير والمظهر المتجانس للنقاط، وعدم تكرار ملاحظة النقاط المتقاربة بشدة، والتي تمثل تجمعات افتراضية من الحويصلات كثيفة الحبيبات (DCV). وفي هذا الشكل النهائي، يتم توضيح طريقة كمية بسيطة لتحديد ما إذا كانت حويصلتان أو أكثر من الحويصلات كثيفة الحبيبات (cvs) متقاربتين بما يكفي لتشكيل تجمع.

يتم إنشاء مقاطع خطية لكثافة النقاط كما هو موضح في الرسوم البيانية، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لقياس كمية المسافة الفاصلة بين الحويصلات الكثيفة (DCV) وعرضها. إذا تجاوزت المسافة الفاصلة العرض بشكل ملحوظ، فإن الـ DCVs لا تتلامس. بينما إذا كانت المسافة الفاصلة مساوية تقريبًا للعرض، فقد تكون الـ CVS في حالة تلامس بناءً على هذه المعايير؛ فقد صُنفت الـ cvs في هذه الصورة على أنها غير متلامسة، بينما صُنفت الـ cvs في هذه الصورة على أنها متلامسة باتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل تقنية PALM ثنائية اللون، لدراسة التموضع النسبي للبنى المتميزة.