استعمال اللوني للغاز لتحليل التغييرات التركيبية من الأحماض الدهنية في الفئران الكبد الأنسجة أثناء الحمل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل تركيبة الأحماض الدهنية في الكبد. يتم تحقيق ذلك عن طريق وزن عينة من الكبد أولا وتجانسها. الخطوة الثانية هي استخراج كل الدهون من عينة الكبد المتجانسة.

بعد ذلك ، يتم فصل فئات الدهون الفردية مثل استرات الكوليسترول باستخدام استخراج الطور الصلب. الخطوة الأخيرة هي التكوين واشتقاق فئات الدهون إلى استرات ميثيل الأحماض الدهنية. في النهاية ، يتم استخدام كروماتوغرافيا الغاز لإظهار كيف يمكن أن تتغير تركيبة الأحماض الدهنية للأنسجة بعد التدخل الغذائي أو تتأثر بالتغيرات في الحالة الفسيولوجية مثل الحمل.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتكوين الأحماض الدهنية في الأنسجة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع العينات الأخرى مثل الزيت والبذور والأطعمة. بشكل عام ، قد يكافح المستخدمون الجدد في هذه التقنية لأن بعض أجزاء البروتوكول تتطلب مهارة يدوية وتحتاج إلى ممارسة ، مثل التجميع المتكرر للمرحلتين العليا والسفلية. سيوضح الإجراء هينا وفيسك وأنيت ويست ، وهي فنية وطالبة دكتوراه من مختبرنا.

قم أولا بقطع ما يقرب من 100 ملليغرام من الكبد المجمد ووزن الأنسجة. ضع الأنسجة في أنبوب بلاستيكي في دلو ثلج وأضف 0.5 مل من المثلج البارد ، 0.9٪ كلوريد الصوديوم. ثم قم بتجانس الأنسجة ونقلها إلى أنبوب زجاجي مغطى بالمسمار الزجاجي.

استخدم 0.3 مل أخرى من 0.9٪ كلوريد الصوديوم لنقل أي أنسجة متبقية إلى الأنبوب المغطى بالمسمار الزجاجي. بعد ذلك ، أضف 100 ميكروغرام من معيار الكوليسترول هيتا ديتشين المذاب في اثنين إلى واحد ، والكلوروفورم الجاف إلى الميثانول إلى الأنبوب ، متبوعا بخمسة ملليلتر إضافي من نفس محلول المذيب الذي يحتوي على 50 ملليغرام لكل لتر من هيدروكسي تولوين البوتيل. بعد إضافة مليلتر واحد من كلوريد الصوديوم المولي ، قم بتغطية الأنبوب واخلط العينة جيدا عن طريق الدوامة حتى تبدو متجانسة.

ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 مرة G لمدة 10 دقائق مع كسر منخفض في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء، اجمع المرحلة السفلية باستخدام زجاج يتجاوز ماصتها وانقلها إلى أنبوب زجاجي جديد بغطاء لولبي. ثم جفف العينة تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية.

في هذه المرحلة ، قم بتوصيل خزان SPE بمضخة تفريغ وضع خرطوشة SPE من بروبيل الأمين على الخزان. ضع أنبوبا زجاجيا جديدا بغطاء لولبي يسمى TAG و CCE في رف الخزان أسفل العمود لجمع الكسر الأول. قم بإذابة مستخلص الدهون الكلي في مليلتر واحد من الكلوروفورم الجاف واخلط العينة عن طريق الدوامة.

بعد ذلك ، انقل العينة إلى العمود باستخدام ماصة معجون زجاجية واترك السائل يتساقط في أنبوب الغطاء اللولبي تحت الجاذبية. عندما لا يقطر السائل من العمود ، قم بإزالة السائل المتبقي بالمكنسة الكهربائية. بعد ذلك ، قم بمسح جزء TAG و CE عن طريق غسل العمود مرتين بمليلتر واحد من الكلوروفورم الجاف تحت الفراغ.

عندما يلمح كل السائل من العمود ، جفف جزء TAG و CE تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. ضع خرطوشة SPE جديدة من أمينو بروبيل السيليكا على خزان SPE وضع أنبوبا زجاجيا ذو غطاء لولبي في درج الخزان أسفل الخرطوشة لتجميع النفايات. اغسل العمود بمليلتر واحد من الهكسان الجاف ثلاث مرات تحت الفراغ.

بعد إيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية ، اغسل العمود بملليلتر أخير من هكسان H تحت الجاذبية. بعد استبدال أنبوب النفايات بأنبوب زجاجي جديد بغطاء لولبي يسمى ce ، قم بإذابة جزء TAG و CE المجفف في مليلتر واحد من الهكسان الجاف واخلط العينة عن طريق الدوامة. ثم انقل العينة إلى العمود باستخدام ممر زجاجي أو ماصة ، واترك السائل يتساقط عبر العمود تحت الجاذبية.

عندما لا يقطر السائل من العمود ، قم بإزالة السائل المتبقي تحت الفراغ تحت الفراغ. اغسل العمود مرتين بمليلتر واحد من الهكسان الجاف لتصفية CE وجفف الجزء الذي تم جمعه تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من التولوين الجاف إلى جزء CE المنفصل واخلط العينة عن طريق الدوامة.

أضف ملليلترا واحدا من كاشف المثيلة المعد مسبقا إلى العينة المذابة في التولوين الجاف. ثم قم بتغطية الأنبوب بإحكام واخلطه سخني العينة برفق لمدة ساعتين عند 50 درجة مئوية. بمجرد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف ملليلتر واحد من محلول المعادل.

بعد ذلك ، أضف واحدة من الهكسان الجاف إلى العينة بعد دوامة الطرد المركزي للعينات عند 250 مرة G لمدة دقيقتين مع كسر منخفض في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء ، اجمع مرحلة الشهرة العليا وانقلها إلى أنبوب زجاجي جديد غير لولبي يمكن التخلص منه. جفف عينة الشهرة المجمعة تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية.

بعد وضع أنبوب النفايات في خزان SPE وهلام السيليكا ، خرطوشة SPE على الخزان ، اغسل العمود ثلاث مرات بمليلتر واحد من الهكسان الجاف تحت الفراغ ومليلتر واحد من الهكسان الجاف تحت الجاذبية. بعد إزالة النفايات يغسل أضف أنبوب نفايات جديدا في الخزان ، ثم قم بإذابة عينة شهرة CE في مليلتر واحد من الهكسان الجاف.

بعد خلط العينة عن طريق الدوامة ، انقلها إلى العمود باستخدام ممر زجاجي أو ماصة. بمجرد أن يقطر السائل عبر العمود تحت الجاذبية ، اغسل العمود ثلاث مرات بمليلتر واحد من الهكسان تحت الفراغ. بعد ذلك ، قم بإزالة غسالات النفايات وضع أنبوبا جديدا غير لولبي يحمل علامة CE fame في الخزان.

قم بتخطيب جزء شهرة CE بملليلترين واحد من 95 إلى خمسة هكسان جاف إلى د إيثيل إيثر. ثم جفف الجزء الذي تم جمعه تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجزء المجفف في 75 ميكرولتر من الهكسان الجاف ، واخلط العينة عن طريق الدوامة بعد خلط العينة عن طريق الدوامة. قم بنقله إلى قارورة عينة تلقائية GC بعد تكرار الخطوة السابقة.

قم بتحليل العينة على كروماتوجراف الغاز إذا تم اتباع البروتوكول بنجاح. يجب الحصول على مخطط كروماتوغرام ذو قمم واضحة ومتناظرة ومحددة جيدا وبأقل قدر من ضوضاء الخلفية كما هو موضح هنا. في حالة حدوث تلوث ، سيظهر الكروماتوجرام قمما إضافية ويظهر قمما غير متناظرة أو منحرفة كما هو موضح هنا.

سيحدث التلوث من الكوليسترول الحر عند تشغيل الشهرة المشتقة من CE ما لم تتم إزالة الكوليسترول. يسمح استخدام مزيج المعايرة المحضر بتحديد الشهرة في العينة. يتم تشغيل مزيج المعايرة باستخدام نفس إعدادات الجهاز مثل العينات بحيث يمكن مقارنة الكروماتوگرام بالعينة والقمم المحددة بناء على أوقات الاحتفاظ بها كما هو موضح هنا.

يتم تسليط الضوء هنا على الذروة الصفرية 16 لتوضيح مقارنة أوقات الاحتفاظ من مزيج المعايرة في الكروماتوجرام العلوي بالأحماض الدهنية. في تتبع العينة السفلية ، يتم استخدام وضع العلامات الصحيحة على مساحة ذروة الأحماض الدهنية لحساب النسبة المئوية للأحماض الدهنية المحددة ضمن الإجمالي. بمجرد جمع البيانات ، من المفيد فحصها بحثا عن القيم المتطرفة كما هو موضح هنا.

يمكن بعد ذلك إجراء مزيد من التحقيق في العينات الخارجية وتكرار الاستخراج و / أو التحليل إذا لزم الأمر. كما هو موضح هنا ، توصف الشهرة داخل كبد الفئران CE كنسبة مئوية من إجمالي الأحماض الدهنية داخل الكبد. تصف هذه البيانات الأحماض الدهنية CE في كبد الفئران البكر أو الحامل التي تتغذى لمدة 20 يوما على واحد من ثلاثة أنظمة غذائية مختلفة.

يكشف التحليل الإحصائي باستخدام عاملين Innova عن تأثيرات كبيرة للنظام الغذائي والحمل على نسبة العديد من الأحماض الدهنية ، بالإضافة إلى تفاعلات النظام الغذائي الكبير عن طريق الحمل. على سبيل التوضيح ، يتأثر محتوى حمض الأونيك في الكبد CE في الفئران الحامل بالنظام الغذائي أكثر من الإناث البكر. تسمح هذه التقنية بإكمال 20 عينة يوميا من البداية إلى النهاية إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بمجرد إتقانها ، يمكن أن يؤدي تجميع العينات إلى زيادة الإنتاجية ومضاعفة الكمية المعالجة في أسبوع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تركيبة الأحماض الدهنية لفئات الدهون الفردية باستخدام استخراج الطور الصلب وكروماتوغرافيا الغاز. لا تنس أن العمل مع المذيبات يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في أغطية الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.