التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات
August 6th, 2014
منارات ثنائي الجزيء Ratiometric (RBMBs) يمكن استخدامها لصورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية. هنا، نحن تصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم من RBMBs إلى الخلايا عن طريق microporation والتصوير الفلورسنت النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير نسخ الحمض النووي الريبي الفردي في الخلايا الحية في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تهجين اثنين من قليل النوكليوتيدات التي تم تصميمها لتشكيل مسبار تشكيل دبوس الشعر المعروف باسم مقياس النسبة بواسطة منارة جزيئية. الخطوة الثانية هي تنقية مقياس النسبة بواسطة منارات جزيئية حسب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
بعد ذلك ، يتم إدخال مقياس النسبة بواسطة المنارات الجزيئية في الخلايا التي تعبر عن هدف الحمض النووي الريبي المصمم هندسيا عبر المسام الدقيقة. الخطوة الأخيرة هي رؤية الخلايا في صفيحة ميكروويل مناسبة للفحص المجهري للخلايا الحية. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الفلوري لمراقبة حركات نصوص الحمض النووي الريبي الفردية التي يتم تصورها على شكل بقع فلورية ساطعة داخل الخلايا المفردة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مجسات اصطناعية مستقرة للصور الساطعة ، وتظهر إشارة عالية إلى الخلفية ، مما يفتح إمكانية تصوير أي RNA داخلي المنشأ ابدأ في إعداد مقياس النسبة بواسطة منارات جزيئية أو RBM BS عن طريق خلط الكواشف التالية في أنبوب. 20 ميكرولتر من Rbm B واحد 30 ميكرولتر من Rbm B اثنين ستة ميكرولتر من 10 × عازلة الفوسفات ، وأربعة ميكرولترات من الحمض النووي والحمض النووي الريبي مجانا من الماء. هذا يكفي عادة لما يقرب من 50 دراسة.
احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد عمود كروماتوغرافيا سائل لإزالة أي اثنين من قليل النوكليوتيدات المهجنة من RBM B من الأمم المتحدة. استخدم 75 طابقا فائقا من الدرجة الإعدادية في عمود كروماتوغرافيا سائل سعة ثمانية ملليلتر بحجم سرير يبلغ حوالي أربعة ملليلتر باستخدام مضخة حقنة تعمل بمعدل تدفق يبلغ 0.6 مل في الدقيقة.
اغسل ووازن SUEx بحوالي 50 مل من مخزن الفوسفات الواحد قبل أن يدخل كل السائل إلى حجم السرير. أوقف مضخة الحقنة وافصلها واترك السائل المتبقي يمر عبر العمود عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، قم بتحميل خليط RBMB على عمود الكروماتوغرافيا.
بعد دخول عينة RBMB بالكامل ، أضف ببطء 250 ميكرولترا أخرى من عازلة الفوسفات x إلى الجزء العلوي من السرير للتأكد من أن العينة بأكملها قد دخلت العمود بالكامل. املأ العمود إلى الحافة بمخزن مؤقت واحد من الفوسفات. أغلق الجزء العلوي وابدأ تشغيل مضخة الحقنة.
تمتلئ المحقنة بحوالي 50 مل من XPBS واحد وتعمل بمعدل تدفق يبلغ 0.6 مل في الدقيقة. عادة ، يمكن تصور عينة RBMB بسهولة بسبب لون الصبغة المدمجة في المسبار. بمجرد أن يقترب RBMB من أسفل العمود ، اجمع التدفق من خلال قطرتين لكل أنبوب طرد مركزي صغير.
توقف عن جمع العينة. بمجرد أن يصبح لون العينة داخل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة واضحا ، اجمع بين الأنابيب التي تحتوي على عينة RBMB الملونة ، عادة من خمسة إلى ستة أنابيب وقم بتحميلها في جهاز مرشح الطرد المركزي. الطرد المركزي العينة عند 10 ، 000 RCF لمدة 20 دقيقة أو حتى الحجم المطلوب.
عادةما ينتج عن هذه السرعة والوقت حجم نهائي يبلغ حوالي 30 ميكرولترا. في هذا البروتوكول ، تم تصميم خط خلايا الساركوما الليفية البشرية للتعبير عن Q-F-P-R-N-A مع 96 تكرارا ترادفيا للتسلسل المستهدف RBMB في UTR الثلاثة الأولية ، تم تصميم خط خلية التحكم للتعبير عن النوع البري Q-F-P-R-N-A قبل يوم واحد من خلايا لوحة توصيل المسبار في قارورة T 25 عند 40 إلى 50٪ ثقافة الطلاقة المشتركة. تستكمل الخلايا ذات وسائط DMEM ب 1٪ بكتيريا القلم و 10٪ مصل بقري الجنين وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي.
قم بتشغيل micro por وقم بإعداد معلمات النقل الدقيقة المحسنة لخلايا HT 10 80. املأ أنبوب المسام الصغير بأربعة ملليلتر من المخزن المؤقت الإلكتروليتي وضعه على محطة التحضير الدقيقة. قم بإذابة عينة مخزون من RBMB المنقى وقم بتخفيف عدة ميكرولترات إلى تركيز نهائي يبلغ 12 ميكرومولار مع مخزن مؤقت واحد من الفوسفات.
هناك حاجة إلى ميكرولتر واحد لكل مسام صغير. لكل تفاعل مسام صغير ، يجب استخدام ماصة ملليلتر واحد من وسط الاستزراع مع FBS ، ولكن بدون مضادات حيوية في أنبوب طرد مركزي صغير. ضعه جانبا بالقرب من جهاز المسام الدقيقة.
سيتم استخدامه لاحقا لتعليق الخلايا مباشرة بعد التحضير الدقيق. لا تستخدم المضادات الحيوية لأنها تقلل من صلاحية الخلية بعد التحضير الدقيق. يجب أن تكون خلايا HT 10 80 المصممة هندسيا المطلية في اليوم السابق الآن من 60 إلى 80٪ ملتقية.
قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا وغسل الخلايا مرة واحدة بمليلتر واحد من الكالسيوم والمغنيسيوم الخالي من المغنيسيوم ، واحتضن DPBS مع مليلتر واحد من التربسين لمدة دقيقة إلى دقيقتين. أوقف التربسين عن طريق إضافة مليلتر واحد من وسائط DMEM المكملة بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ بدون مضادات حيوية وفينول أحمر ونقل الخلايا إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. قم بتدوير الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الصغير بمعدل 200 مرة G لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها ودمج كريات الخلية في حجم نهائي من مليلتر واحد DPBS. قم بإزالة 10 ميكرولتر من معلق الخلية المختلطة جيدا لحساب الخلايا ، وقم بسحب الخلايا لأعلى ولأسفل عدة مرات للتأكد من أنها مشتتة جيدا ونقل 300،000 خلية مع DPBS إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. تدور عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات في 11 ميكرولترا من تعليق Resus والمخزن المؤقت والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان تشتت الخلايا جيدا. تأكد من عدم توليد أي فقاعات هواء.
أضف ميكرولتر واحد من RBMB المخفف واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. مرة أخرى ، احرص على عدم توليد أي فقاعات هواء. من الأهمية بمكان تجنب إدخال أي فقاعة هواء في تعليق مبيعات RBMB لأن فقاعات الهواء ستسبب شرارة أثناء التشغيل الصغير وتؤدي إلى ضعف توصيل RBMB وموت الخلايا.
باستخدام ماصة التحضير الدقيقة، قم بشفط 10 ميكرولترات من خليط الخلية RBMB وأدخل الماصة في أنبوب التحضير الدقيق. اضغط على زر البدء لبدء الشركة الصغيرة. يجب ألا تكون هناك فقاعات هواء مرئية في الطرف عندما تظهر شاشة المبور الصغير الاكتمال.
قم بإزالة الماصة من المحطة وطرد خليط سعة 10 ميكرولتر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعد مسبقا والذي يحتوي على ملليلتر واحد من وسط الاستزراع مع FBS ، ولكن بدون خلط المضادات الحيوية برفق عن طريق هز الأنبوب من جانب إلى آخر عدة مرات. قم بتدوير الخلايا عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق. اغسل الخلايا مرتين في مليلتر واحد من وسط الثقافة الخالي من الفينول الأحمر باستخدام FBS ، ولكن بدون مضادات حيوية لإزالة أي بكتيريا قصيرة الجذعية لم يتم تسليمها إلى الخلايا.
بعد الغسيل الثاني. يعلق Resus الخلايا في 400 ميكرولتر من وسط الزراعة الخالي من الفينول الأحمر مع FBS ، ولكن بدون مضادات حيوية. قم بوضع الخلايا التناسبية الدقيقة في زجاج غطاء مغطى بثمانية غرف جيدة محضر مسبقا بسعر 200 ميكرولتر لكل بئر أو بالطلاقة المطلوبة.
ضع زجاج الغطاء الحجري في حاضنة زراعة الخلايا. يمكن إجراء التصوير في أقرب وقت بعد 30 دقيقة من التحضير المجهري. لبدء هذا الإجراء ، قم بتشغيل نظام الحضانة العلوي للخلية الحية وقم بتوازنه حتى تصل إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 75٪ رطوبة.
قم بتشغيل المجهر ومصدر ضوء الفلورسنت وافتح برنامج الحصول على الصور المتحولة. ضع الزيت الغامر على الهدف. انقل زجاج الغطاء المخزن بخلايا مسام دقيقة إلى مرحلة الخلية الحية.
أعلى نظام حضانة. احتضان نظام المرحلة العلوي حتى تستقر درجة الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون. افتح علامة التبويب اكتساب في برنامج التحويل.
انقر فوق الزر إظهار مباشر للعثور على الحقل. اضبط التركيز تحت الضوء الأبيض وانقر فوق الزر إيقاف البث المباشر. ضمن علامة التبويب اكتساب.
انقر وافتح الزر المنبثق للحصول على البث وقم بإعداد معلمات الحصول على الأفلام المطلوبة. احصل على 150 إطارا باستخدام مرشح SCI five CF six 40 R. احفظ الصور على القرص الصلب.
تظهر هنا صور تمثيلية ل HT 10 80 خلية تعبر بثبات عن الحمض النووي الريبي مع 96 تكرارا ترادفيا ، أو أربعة تكرارات ترادفية لموقع ربط RBMB في UTR الرئيسية الثلاثة. بعد توصيل mbs داخل الخلايا. يسمح وجود 96 تكرارا ترادفيا لنسخ الحمض النووي الريبي الفردية بالظهور كبقع فلورية ساطعة.
في المقابل ، يظهر الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على أربعة تكرارات ترادفية فقط كبقع فلورية خافتة جدا وغالبا ما لا يمكن اكتشافها إلا في المناطق ذات الخلفية المنخفضة بشكل استثنائي. يسمح الحصول على الصور المتدفقة بتصوير نصوص الحمض النووي الريبي الفردية في الوقت الفعلي. يمكن رؤية نصوص الحمض النووي الريبي الفردية بسهولة داخل السيتوبلازم ونواة الخلايا التي تخضع لحركات براونية أو فرعية انتشارية.
في حالات نادرة ، سيلاحظ الحمض النووي الريبي الذي يخضع للنقل الموجه كما هو موضح هنا. عادة ما تتحرك نصوص الحمض النووي الريبي التي تخضع للنقل الموجه بسرعة على طول مسار مستقيم. في هذا المونتاج ، يظهر مسار نسخة الحمض النووي الريبي متراكبا على إطار واحد من السلسلة الزمنية.
تتوافق حركات الحمض النووي الريبي الموجهة مع نقل الحمض النووي الريبي على طول الأنابيب الدقيقة والخيوط الدقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتنقية المقياس العرقي بواسطة المنارات الجزيئية. قم بتوصيل المقياس العرقي عن طريق المنارات الجزيئية إلى الخلايا عبر الباريون الصغير وصور نصوص الحمض النووي الريبي المفردة بواسطة المجهر الفلوري.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة استخدام المنارات الثنائية القياسية (RBMBs) لتصوير نصوص RNA هندسية مفردة في الخلايا الحية. يتضمن الإجراء تهجين الأوليغونوكليوتيدات لتشكيل مسبار شعري، وتنقية RBMBs، وتوصيلها إلى الخلايا للتصوير الفلوري في الوقت الفعلي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- التصوير الفلوري
الخلفية
- تم تصميم RBMBs لتصور نصوص RNA.
- يسمح التصوير في الوقت الفعلي بملاحظة ديناميكيات RNA.
- تعزز الطريقة فهم سلوك RNA في الخلايا الحية.
- يوفر التصوير الفلوري قدرات تصوير عالية الدقة.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لتصوير نصوص RNA المفردة في الخلايا الحية.
- تحسين توصيل وتصور أهداف RNA الهندسية.
- تمكين المراقبة في الوقت الفعلي لحركات RNA.
الطرق المستخدمة
- تهجين الأوليغونوكليوتيدات لتشكيل RBMBs.
- تنقيح RBMBs باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي.
- إدخال RBMBs إلى الخلايا عن طريق الميكروبوريشن.
- التصوير الفلوري لتصوير نصوص RNA.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لرويات RNA المفردة في الخلايا الحية.
- تصور في الوقت الفعلي لحركات RNA كنقاط مضيئة فلوريدية.
- تبيان فعالية RBMBs في البيئات الخلوية.
- رؤى حول ديناميكيات RNA الهندسي في الأنظمة الحية.
الاستنتاجات
- RBMBs هي أداة قوية لدراسة ديناميكيات RNA في الخلايا الحية.
- توفر الطريقة منهجاً جديداً لتصور سلوك RNA.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية دراسة تفاعلات RNA ووظائفه.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Real-time imaging of single RNA transcripts enables direct observation of gene expression dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ratiometric bimolecular beacon approach provides quantitative, spatially resolved data on RNA behavior, enhancing predictive confidence in preclinical models. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses by clarifying RNA localization, transport, and stability in living systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing RNA transcript localization and movement in live cells.
- Operational Value: Provides functional validation of engineered RNA targets through direct fluorescence readout.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing RNA stability and subcellular distribution under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates discrete fluorescent spots that serve as quantifiable readouts for RNA expression and localization.
- Reproducibility: Utilizes purified, photostable probes to ensure consistent signal across experiments and time.
- Scalability: Compatible with microporation delivery and standard wide-field fluorescence microscopy for broader application.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling real-time monitoring of RNA dynamics in disease-relevant cellular models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies RNA transport mechanisms (e.g., microtubule-associated movement) to inform target mechanism of action.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing empirical data on RNA behavior in living systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering a direct readout of RNA behavior that informs lead identification and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of RNA transcript dynamics in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative fluorescence outputs that allow comparison of RNA expression levels and localization patterns.
- Analytics: Generates time-series imaging data that facilitate quantitative analysis of RNA movement, diffusion, and transport kinetics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing observation of RNA behavior in living cells under near-physiological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple RNA targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in RNA localization, stability, and function.
- Operational Value: Ensures standardization through probe purification and standardized delivery via microporation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of RNA-targeted therapeutic approaches.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization through direct visualization of RNA dynamics in relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide probe design, purification, and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to microporation equipment and compatible cell culture systems.
- Necessitates standardization of probe concentration and delivery parameters across teams.
- Requires adaptation for different RNA targets and cellular backgrounds to avoid overexpression artifacts.
- Limited by the need to engineer RNA transcripts with tandem repeat sequences for effective beacon binding.
