المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تكرار الطفرات المستحثة في جين مراسل تم استعادته من الخلايا الجرثومية للفئران المعدلة وراثياً من الذكور بعد تعريضها لمطفر كيميائي أو فيزيائي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعريض ذكور الفئران لمادة يشتبه في كونها مطفراً للخلايا الجرثومية. وتتمثل الخطوة الثانية في جمع الخلايا الجرثومية بعد مرورها بالمراحل المطلوبة من عملية تكوين الحيوانات المنوية.

بعد ذلك، يتم استعادة الحمض النووي DNA الذي يحتوي على ترانسجين التقرير الطافر من الخلايا الجرثومية. وتتمثل الخطوة النهائية في تعبئة جينات التقرير المستعادة في جسيمات عاثية لامدا lambda phage. وفي النهاية، يُستخدم اختبار اختيار إيجابي في المختبر in vitro لقياس نسبة جينات التقرير المستعادة من الخلايا الجرثومية التي حدثت لها طفرات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل اختبار الموقع المحدد أو اختبار دومينو ليتل، في إمكانية قياس الطفرات مباشرة في الخلايا الجرثومية بدلاً من تقييم النسل الطافر. حيث يمكن فحص عدد كبير من الخلايا الجرثومية من ذكر واحد، مما يعزز حساسية المقايسة مقارنة بالطرق التقليدية، وفي الوقت ذاته يقلل بشكل كبير من الموارد الحيوانية والوقت المطلوب. ويمكن لهذه الطريقة أن تعالج قضايا محورية في مجال السموم الجينية والطفرات، مثل تحديد العوامل المسببة للطفرات في الخلايا الجرثومية وتوضيح آليات عملها.

على الرغم من أننا نصف الطريقة باستخدام نموذج فأر Muta، إلا أنه يمكن تطبيقها بسهولة على أنظمة القوارض المعدلة وراثياً الأخرى التي تحمل نواقل الإبلاغ عن طفرات العاثيات البكتيرية. علاوة على ذلك، وبينما تصف الطريقة العملية بالنسبة للخلايا الجرثومية الذكرية، فإن لها قابلية تطبيق عامة على الأنسجة الجسدية، والأهم من ذلك أنها مشمولة في دليل اختبار متوافق دولياً نشرته منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (OECD). وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في توقيت الجزء المخبري (in vitro) من المقايسة لأن العديد من الخطوات تتطلب فترات انتظار طويلة.

يجب تخطيط الخطوات وتنسيقها بعناية لإتمام هذه الطريقة في الوقت المحدد. سيقوم كل من جون جينجريتش وليندا سوبر، وهما باحثان في مختبري، بشرح الإجراء قبل البدء في التجربة. كما يجب اختيار ثلاثة متغيرات تجريبية حرجة، وهي: وقت الإعطاء، ووقت أخذ العينات، ومجموعة الخلايا الجرثومية التي سيتم جمعها.

يمكن ضبط هذه المتغيرات لاستقصاء تأثيرات التعرض في أنواع مختلفة من الخلايا الجرثومية وفي مراحل مختلفة من عملية تكوين الحيوانات المنوية. لبدء هذا الإجراء، يتم توزيع ذكور الفئران المعدلة وراثياً، والتي تتراوح أعمارها بين ثمانية إلى 12 أسبوعاً، عشوائياً على مجموعة ضابطة ومجموعات معالجة، بحيث تضم كل مجموعة خمسة فئران على الأقل. بعد ذلك، تُعالج الفئران بالمركب المختبر والضابط ذي الصلة عبر مسار التعرض المناسب لفترة الإعطاء المحددة.

بعد ذلك، اختر وقت أخذ العينات المناسب وفقاً لنوع الخلايا الميتاجينية للحيوانات المنوية محل الدراسة. ثم بعد حلول وقت أخذ العينات، قم بقتل الفئران عن طريق خلع الفقرات العنقية تحت تخدير isof fluorine. لإزالة الخصيتين، قم بإجراء شق في البطن، وحدد موقع وسادة الدهون البشرية.

اسحب الوسادة الدهنية بعناية لإخراج الخصيتين والبربخ من كيس الصفن. بعد ذلك، قم باستئصال البربخ. جمد البربخ في النيتروجين السائل واحفظه في درجة حرارة -80 °C لاستخدامه لاحقاً.

عندما تصبح جاهزاً لمعالجة حيوانات sperm الخاصة بـ Cota، قم بإذابة Cota epididymus على الثلج ثم انقل الـ cota المذاب إلى أطباق Petri. بعد ذلك، استخدم مشرطاً أو شفرة حلاقة لفرم coda Epididymus جيداً، ثم اسحب باستخدام الماصة 700 µL من DPBS بدرجة حرارة الغرفة في طبق Petri. بعد ذلك، استخدم رأس ماصة 1000 µL واسع الفتحة لتحرير الـ sperm من الـ coda عن طريق سحب وإطلاق المعلق حوالي 10 مرات أو حتى يصبح DPBS عكراً بوجود الـ sperm، ثم قم بترشيح معلق الـ sperm عبر مرشح شبكي من الفولاذ المقاوم للصدأ في أنبوب 1.5 mL جديد، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 11,000 ×g لمدة ثلاث دقائق.

قم بسحب السائل الطافي من الأنبوب بحذر دون تعكير الراسب. بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول سترات الصوديوم الملحية البارد بتركيز 1x، وقم برج الأنبوب بجهاز vortext حتى يتم إعادة تعليق الراسب تماماً. بعد ذلك، أضف 15 µL من SDS بتركيز 10% إلى الأنبوب ورج الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية لتحليل الخلايا غير المنوية.

بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 11,000 ×g لمدة دقيقتين. وبعد عملية الطرد المركزي، قم بسكب السائل الطافي من الأنبوب بعناية، وأضف 940 µL من محلول سترات الصوديوم الملحية الباردة بتركيز 0.2x، ثم قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المرج (vortex) مرة أخرى حتى يتم إعادة تعليق الراسب. أضف 120 µL من A beta mer capto ethanol و100 µL من 10% SDS و20 µL من 0.5 molar EDTA بـ pH 8 و20 µL من تركيز 60 mg/mL.

أضف Proteinase K إلى الحيوانات المنوية المعاد تعليقها. اخلط المحلول جيداً، ثم ضع الأنبوب على جهاز تدوير (rotator) طوال الليل عند 37 درجة مئوية لإتمام عملية الهضم. بعد الهضم الليلي، استخلص الـ DNA من الحيوانات المنوية في ذيل البربخ باتباع الخطوات الموضحة في البروتوكول النصي لإجراء استخلاص باستخدام الفينول والكلوروفورم بعد عملية الاستخلاص.

أذب راسب الـ DNA في 40 إلى 100 µL من محلول tris EDTA buffer بـ pH 8 واحفظه في درجة حرارة 4 °C. اترك الـ DNA لعدة أيام حتى يذوب تماماً قبل الانتقال إلى الخطوة التالية في ذلك اليوم. قبل إجراء مقايسة طفرة LAX Z، قم بتحضير وتعقيم كمية كافية من bottom auger بما يتناسب مع عدد العينات التي يتم معالجتها.

بعد ذلك، قم بصب الآجار بطريقة معقمة في أطباق بتري مقاس 90 millimeter واترك الآجار يتصلب في أنبوب سعة 50 milliliter. أضف 10 milliliters من مرق LB، و100 microliters من محلول maltose بتركيز 20%، و25 microliters من ampicillin بتركيز 20 milligrams per milliliter، و20 microliters بتركيز five milligrams per milliliter من Can mycin ثم قم بتلقيح الأنبوب بـ LAX Z negative GAL e negative e coli، واتركه ينمو طوال الليل عند 37 degrees Celsius مع الرج بسرعة 240 RPM. في اليوم الأول من المقايسة، قم باستزراع الخلايا ثانوياً عن طريق تحضير تخفيف بنسبة 1 to 100 من المزرعة التي نمت طوال الليل في مرق LB طازج بدون مضادات حيوية.

حضّن المزرعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 240 RPM لمدة ثلاث ساعات تقريباً أو حتى تصل قيمة OD 600 إلى واحد. وبمجرد وصول OD 600 إلى واحد، قسّم معلق الخلايا بالتساوي في أنابيب سعة 50 مل، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1,300 ×g عند درجة حرارة 15 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في نصف الحجم الأصلي من وسط LB الذي يحتوي على 10 millimolar من كبريتات المغنيسيوم.

ضع الخلايا جانبًا أثناء تحضير الكواشف الأخرى. قم بتغليف DNA في جزيئات عاثية Lambda عن طريق سحب 4 µL من DNA المستخلص من حيوانات coda المنوية باستخدام ماصة واسعة الفتحة ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 mL.

قم بإذابة الأنبوب الأول من طقم مستخلص تغليف العاثيات (phage packaging extract kit) في درجة حرارة الغرفة، ثم اسحب بواسطة الماصة 4.8 µL من مستخلص التغليف وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على DNA. بعد ذلك، قم بتقليب المحلول برفق باستخدام طرف الماصة، ثم حضن الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 30 °C لمدة 1.5 ساعة. تالياً، قم بإذابة أنبوب مستخلص التغليف الثاني، واسحب مرة أخرى 4.8 µL وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على DNA.

قم بتحريك المحلول بلطف باستخدام طرف الماصة، ثم حضن الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 30 °C لمدة 1.5 ساعة. أعد تعليق جزيئات العاثية المعبأة في 500 µL من محلول منظم ملحي للمغنيسيوم، وضع الأنابيب على جهاز تدوير لمدة 30 دقيقة بسرعة 20 RPM. بعد التدوير، قم برج العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex، ثم قم بالطرد المركزي عند 11,000 ×g لمدة 30 ثانية لتجميع العينات في قاع الأنبوب.

أصبحت جسيمات العاثيات الآن جاهزة للعدوى. بعد ذلك، قم بتحضير ثمانية ملليلترات من الطبقة العلوية (top auger) لكل لوحة قياس عيار ولوحة طفرات. حافظ على درجة حرارة الطبقات العلوية عند 50 درجة Celsius قبل إضافة كبريتات المغنيسيوم ليكون التركيز 10 millimolar، وأضف ثلاثة جرامات لكل لتر من العامل الانتقائي PGAL إلى عملية اختيار الطفرات.

يُستخدم البرغي العلوي فقط قبل إصابة الخلايا. قم بتمييز أنبوبين سعة 50 milliliter لكل عينة، بحيث يتم تمييز أحدهما بـ "طفرة" (mutant) والآخر بـ "عيار" (titer). بعد ذلك، قم بتمييز ثماني أطباق برغي لكل عينة، أربعة للطفرة وأربعة للعيار.

بعد ذلك، انقل باستخدام الماصة 2 mL من الخلايا المعاد تعليقها إلى كل أنبوب سعة 50 mL. أضف 500 µL من جزيئات العاثية المعبأة إلى أنبوب سعة 50 mL مُسمى "mutant". اخلط الأنبوب برفق واترك جزيئات العاثية تصيب الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد فترة تحضين مدتها 30 دقيقة، قم برج الخلايا المصابة لفترة وجيزة باستخدام جهاز الفورتيكس، ثم انقل 15 µL من الخلايا المصابة إلى أنبوب قياس العيار سعة 50 mL المقابل. أضف 30 mL من سائل الـ auger الخاص بقياس العيار بدرجة حرارة 50 °C إلى أنبوب قياس العيار سعة 50 mL. قم بتوزيع خليط الـ auger والخلايا فوراً على ألواح قياس العيار الأربعة.

تأكد من إضافة 3 g/L من P gal إلى وسط اختيار الطفرات عند درجة حرارة 50 °C. بعد ذلك، أضف 30 mL من وسط اختيار الطفرات المحتوي على PGAL إلى أنبوب الطفرات سعة 50 mL. ثم قم على الفور بتوزيع كمية خليط الوسط والخلايا على أطباق الطفرات الأربعة.

اترك الأطباق حتى تتصلب، ثم اقلب الأطباق وقم بتحضينها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. وبعد التحضين الليلي، قم بعدد اللويحات في أطباق الطفرات وأطباق العيار. ثم قدّر تردد الطفرات بقسمة العدد الإجمالي للويحات الطفرات التي تم عدها في أطباق الطفرات الأربعة على العدد الإجمالي التقديري لوحدات تكوين اللويحات في الحجم الكلي للخلايا المصابة والذي تم تحديده من أطباق العيار.

يؤدي اختبار طفرات الخلايا الجرثومية النموذجي للقوارض المعدلة وراثياً إلى ظهور عدد قليل جداً من اللويحات على أطباق المزارع الطافرة، خاصة في مجموعات الجرعات الضابطة. وفي المقابل، يتم اكتشاف مئات اللويحات على أطباق تحديد العيار. وقد سمح تعريض ذكور الفئران من سلالة mutt لجرعة فموية حادة واحدة من ENU بتركيزات 0 و 25 و 50 و 100 milligrams per kilogram، متبوعة بفترة أخذ عينات مدتها 70 يوماً، بقياس الأحداث الطفرية في الخلايا الجذعية المكونة للنطاف.

أدت الجرعة المنخفضة من ENU إلى زيادة في تردد الطفرات بمقدار 2.6 ضعفاً مقارنة بالمجموعات الضابطة، بينما أحدثت الجرعة القصوى زيادة بمقدار 4.4 ضعفاً. وعند تصميم التجارب التي تستخدم هذا الإجراء، من المهم دائماً مراعاة التوقيت؛ إذ يجب اختيار دورة تحول النطاف (sperm metagenic cycle)، ووقت الإعطاء، ووقت أخذ العينات، ونوع الخلايا التي يتم جمعها بعناية من أجل رصد التأثيرات الناشئة عن نوع خلايا تحول النطاف المطلوب.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تسلسل DNA للبقع الطافرة لتوصيف الطفرات وتحديد الطفرات التي قد تكون ناتجة عن أحداث التوسع النسلي. يمهد هذا الأسلوب الطريق للباحثين في مجال السموم الجينية لتحديد المواد المسببة للطفرات التي قد تستهدف الخط الجرثومي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تردد الطفرات المستحثة في الخلايا الجرثومية أو في ذكور الفئران المعدلة وراثياً والمعرضة لمادة مسببة للطفرات.

لهذا المقايسة تطبيقات محتملة في الاختبارات التنظيمية للمواد المطفّرة للخلايا الجنسية، وفي استقصاءات ميكانيكية أكثر استهدافاً.