المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تواتر الطفرات المستحثة في جين المراسل المستعاد من الخلايا الجرثومية لذكور الفئران المعدلة وراثيا بعد التعرض لملطفرات الكيميائية أو الفيزيائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض ذكور الفئران أولا لمطفرات الخلايا الجرثومية المشتبه بها. الخطوة الثانية هي جمع الخلايا الجرثومية بعد تقدمها خلال المراحل المرغوبة من تكوين المنوية.

بعد ذلك ، يتم استرداد الحمض النووي الذي يحتوي على الطفرة التي تبلغ عن الجين المعدل من الخلايا الجرثومية. الخطوة الأخيرة هي تعبئة جينات المراسل المستردة في جزيئات عاثيات لامدا. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة الانتقاء الإيجابي في المختبر لقياس نسبة جينات المراسل المستردة من الخلايا الجرثومية التي تم تحورها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل اختبار الموضع المحدد أو اختبار الدومينو الصغير ، هي أن الطفرات تقاس مباشرة في الخلايا الجرثومية بدلا من تسجيل ذرية متحولة. يمكن التحقيق في عدد كبير من الخلايا الجرثومية من ذكر واحد ، مما يحسن حساسية الاختبار على الطرق التقليدية ، مع تقليل عدد موارد والوقت بشكل كبير في نفس الوقت. يمكن لهذه الطريقة أن تعالج القضايا الرئيسية في مجال علم السموم الوراثية والطفرات ، مثل تحديد العوامل المطفرة للخلايا الجرثومية وتوضيح طرق عملها.

على الرغم من أننا نصف طريقة نموذج الفأر موتا ، إلا أنه يمكن تطبيقها بسهولة على أنظمة القوارض المعدلة وراثيا الأخرى التي تحمل ناقلات الإبلاغ عن طفرات العاثيات البكتيرية. علاوة على ذلك ، في حين أن الطريقة تصف عملية الخلايا الجرثومية الذكرية ، إلا أنها قابلة للتطبيق بشكل عام على الأنسجة الجسدية ، والأهم من ذلك ، أنها مشمولة بإرشادات اختبار منسقة دوليا نشرتها منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع توقيت الجزء المختبري من الفحص لأن العديد من الخطوات لها فترات انتظار طويلة.

يجب تخطيط الخطوات وتنسيقها بعناية لإكمال هذه الطريقة في الوقت المناسب. سيوضح الإجراء عالم الأحياء جون غينغريتش وليندا سوبر في مختبري قبل بدء التجربة. يجب اختيار ثلاثة متغيرات تجريبية مهمة ، وقت الإعطاء ، ووقت أخذ العينات ، ومجموعة الخلايا الجرثومية التي تم جمعها.

يمكن تعديل هذه المتغيرات لاستجواب تأثيرات التعرض في أنواع مختلفة من الخلايا الجرثومية وفي مراحل مختلفة من تكوين المنوية. لبدء هذا الإجراء ، قم بتوزيع الفئران الذكور المعدلة وراثيا التي تتراوح أعمارها بين ثمانية و 12 أسبوعا بشكل عشوائي في مجموعة تحكم ومجموعات علاج بحد أدنى خمسة لكل مجموعة. ثم عالج الفئران بمركب اختبار وعنصر تحكم ذي صلة عبر طريق تعرض مناسب لوقت الإدارة المحدد.

بعد ذلك ، اختر وقت أخذ العينات المناسب وفقا لنوع الخلية الميتجانيك للحيوانات المنوية ذات الاهتمام. ثم بعد حدوث وقت أخذ العينات ، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت تخدير الفلور. لإزالة الخصيتين ، قم بعمل شق في البطن ، وحدد موقع وسادة دهون البشرة.

اسحب الوسادة الدهنية بحذر لسحب الخصيتين والبربخ من كيس الصفن. ثم استئصال كوتا البربيضيموس. قم بتجميد Cota Epididymus في النيتروجين السائل وتخزينه في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه لاحقا.

عندما تكون جاهزا لمعالجة المنوية من كوتا ، قم بإذابة كوتا البربخية على الجليد ثم انقل الكوتا المذابة إلى طبق بتري. بعد ذلك، استخدم مشرطا أو شفرة حلاقة لفرم ماصة كودا البرديديموس 700 ميكرولتر من DPBS بدرجة حرارة الغرفة في طبق بتري. ثم استخدم طرف ماصة عريض التجويف سعة 1000 ميكرولتر لتحرير المنوية من الكودا عن طريق سحب وتحرير التعليق حوالي 10 مرات أو حتى يصبح DPBS غائما مع المنوية ، قم بتصفية تعليق المنوية من خلال مرشح شبكي من الفولاذ المقاوم للصدأ في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 11 ، 000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق.

قم بإخراج المادة الطافية بعناية من الأنبوب دون إزعاج الحبيبات. ثم أضف ملليلترا واحدا من البرد ، وواحد × سترات الصوديوم المالحة ، وقم بدوامة الأنبوب حتى يتم تعليق الحبيبات تماما. بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من 10٪ SDS إلى الأنبوب وقم بهز الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية لتعطيل الخلايا غير المنوية.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 11 ، 000 مرة G لمدة دقيقتين. بعد الطرد المركزي ، قم بصب المادة الطافية بعناية من الأنبوب وأضف 940 ميكرولتر من سترات الصوديوم المالحة الباردة 0.2 ، وقم بتدوير الأنبوب مرة أخرى حتى يتم تعليق الحبيبات. أضف 120 ميكرولتر من الإيثانول بيتا مير كابتو 100 ميكرولتر من 10٪ SDS و 20 ميكرولتر من 0.5 مولار ودرجة الحموضة EDTA ثمانية و 20 ميكرولتر من 60 ملليغرام لكل مليلتر.

بروتيناز K إلى المنوية المعلقة. اخلطي المحلول جيدا ثم ضعي الأنبوب على محور دوار طوال الليل عند 37 درجة مئوية حتى يهضمه بعد الهضم طوال الليل. استخرج الحمض النووي من المنوية الكودا باتباع الخطوات الموضحة في بروتوكول النص لإجراء استخراج كلوروفورم الفينول بعد الاستخراج.

قم بإذابة ترسيب الحمض النووي في 40 إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت ل tris EDTA PH ثمانية وتخزينه عند أربع درجات مئوية. اترك عدة أيام حتى يذوب الحمض النووي تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية في اليوم. قبل إجراء مقايسة طفرة LAX Z ، قم بإعداد كمية كافية من المثقاب السفلي وتعقيمها لعدد العينات التي تتم معالجتها.

ثم بشكل معقم ، اسكب المثقاب في أطباق بتري 90 ملم واترك المثقاب يتجمد في أنبوب سعة 50 مل. أضف 10 مل من مرق LB ، و 100 ميكرولتر من محلول المالتوز بنسبة 20٪ ، و 25 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل مليلتر أمبيسلين ، و 20 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر. يمكن بعد ذلك تلقيح المايسين الأنبوب ب LAX Z سالب GAL e سالب e القولونية ، وينمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 240 دورة في الدقيقة في اليوم الأول من الزراعة الفرعية للفحص عن طريق تحضير تخفيف واحد إلى 100 من الثقافة الليلية في LB الطازج بدون مضادات حيوية.

احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 240 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث ساعات تقريبا أو حتى يساوي OD 600 واحدا. بمجرد أن يصل OD 600 إلى واحد ، قسم تعليق الخلية بالتساوي إلى أنابيب سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 300 مرة G عند 15 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في نصف الحجم الأصلي للرطل الذي يحتوي على 10 مللي مولار من كبريتات المغنيسيوم.

ضع الخلايا جانبا أثناء تحضير الكواشف الأخرى. قم بتعبئة الحمض النووي في جزيئات عاثيات لامدا عن طريق سحب العينات أولا. أربعة ميكرولترات من الحمض النووي المستخرج من المنوية الكودا باستخدام ماصة واسعة التجويف في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

قم بإذابة الأنبوب الأول من مجموعة مستخلصات عبوات العاثيات في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتقطيع 4.8 ميكرولتر من مستخلص العبوة في الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي. بعد ذلك ، حرك المحلول برفق باستخدام طرف الماصة ثم احتضن الأنبوب في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك ، قم بإذابة أنبوب استخراج العبوة الثاني ومرة أخرى ، قم بوضع 4.8 ميكرولتر في الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي.

حرك المحلول برفق باستخدام طرف الماصة ثم احتضن الأنبوب في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. أعد تعليق جزيئات العاثيات المعبأة في 500 ميكرولتر من محلول المغنيسيوم الملحي ، وضع الأنابيب على دوار لمدة 30 دقيقة عند 20 دورة في الدقيقة. بعد الدوران ، قم بدوامة العينات لفترة وجيزة ثم جهاز الطرد المركزي عند 11 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب.

جزيئات العاثيات جاهزة الآن للعدوى. بعد ذلك ، قم بإعداد ثمانية ملليلتر من المثقاب العلوي لكل عيار ولوحة متحولة. حافظ على المثاقب العلوية عند 50 درجة مئوية قبل إضافة كبريتات المغنيسيوم إلى 10 مللي مولار وأضف ثلاثة جرامات لكل لتر من العامل الانتقائي PGAL إلى الاختيار الطافرة.

المثقاب العلوي فقط قبل إصابة الخلايا. قم بتسمية أنبوبين سعة 50 مليلتر لكل ملصق عينة ، أحدهما متحور وعيار واحد. ثم قم بتسمية ثماني لوحات مثقاب لكل عينة ، وأربعة طفرة وأربعة عيارات.

بعد ذلك ، قم بإدخال ملليلترين من الخلايا المعلقة في كل أنبوب سعة 50 مل. أضف 500 ميكرولتر من جزيئات العاثيات المعبأة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يسمى متحول. امزج الأنبوب برفق واترك جزيئات العاثيات تصيب الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم بتدوير الخلايا المصابة لفترة وجيزة ثم انقل 15 ميكرولترا من الخلايا المصابة إلى أنبوب العيار المقابل 50 ملليلترا. أضف 30 مل من المثقاب العلوي للعيار 50 درجة مئوية إلى أنبوب عيار 50 مل. قم بتوزيع خليط المثقاب والخلية على الفور بين ألواح العيار الأربعة.

تأكد من إضافة ثلاثة جرامات لكل لتر من جالون P إلى مثقاب الاختيار المتحور بدرجة حرارة 50 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 30 مل من مثقاب الاختيار المتحور الذي يحتوي على PGAL إلى أنبوب 50 مليلتر المتحور. ثم قم على الفور بتوزيع كمية خليط المثقاب والخلية على الألواح الأربع الطافرة.

اسمح للصفائح بالتصلب ثم اقلبها واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة الليلية ، احسب عدد اللويحات على ألواح الطافرة والعيار. ثم قم بتقدير تردد الطفرة بقسمة العدد الإجمالي للويحات الطافرة التي تم حسابها ، محسوبة على الصفائح الطافرة الأربعة على العدد الإجمالي المقدر لوحدات تكوين البلاك في الحجم الإجمالي للخلايا المصابة المحددة من ألواح العيار.

عن مقايسة طفرة الخلايا الجرثومية للقوارض المعدلة وراثيا عدد قليل جدا من اللويحات على ألواح المثقاب الطافرة ، خاصة في مجموعات الجرعات الضابطة. بينما من ناحية أخرى ، يتم اكتشاف مئات اللويحات على ألواح العيار. سمح تعرض ذكور الفأر المغفل لجرعة واحدة حادة عن طريق الفم تبلغ 0 و 25 و 50 و 100 ملليغرام لكل كيلوغرام من ENU متبوعا بوقت أخذ عينات مدته 70 يوما بقياس الأحداث الطفرية في الخلايا الجذعية للحيوانات المنوية.

تسببت الجرعة المنخفضة من ENU في زيادة 2.6 مرة في التردد الطافرة فوق الضوابط ، وأثارت الجرعة القصوى زيادة قدرها 4.4 ضعف. أثناء تصميم التجارب التي تستخدم هذا الإجراء ، من المهم دائما مراعاة توقيته. يجب اختيار دورة المنوية الميتجينة ، ووقت الإعطاء ، ووقت أخذ العينات ، ونوع الخلية التي تم جمعها بعناية من أجل مراقبة التأثيرات الناشئة عن نوع الخلية الميتجانيك للحيوانات المنوية المطلوبة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تسلسل الحمض النووي على اللويحات الطافرة لتوصيف الطفرات وتحديد الطفرات التي قد تكون مشتقة من أحداث التمدد النسيلي. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم السموم الوراثية لتحديد المطفرات التي قد تستهدف السلالة الجرثومية بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد التردد المتحور المستحث في الخلايا الجرثومية أو ذكور الفئران المعدلة وراثيا المعرضة للطفرات.

هذا الاختبار له تطبيقات محتملة في الاختبارات التنظيمية لطفرات الخلايا الكريمة ، وفي التحقيقات الميكانيكية الأكثر استهدافا.