تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من كولاي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية الإيلاستين المؤتلف مثل عديد الببتيدات من الإشريكية القولونية عن طريق دورة الانتقال العكسي. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع المحللة أولا من الخلايا الإشريكية القولونية التي عبرت عن الإيلاستين المؤتلف مثل عديد الببتيد ، وإزالة الحطام الخلوي غير القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي. الخطوة الثانية هي إزالة الملوثات القابلة للذوبان عن طريق إحداث انتقال الإيلاستين مثل البولي ببتيد مع إضافة الملح أو الحرارة.

ثم جمع الإيلاستين مثل طبقة البولي ببتيد عن طريق الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية. تسمى هذه الخطوة بالدوران الساخن. بعد ذلك ، فإن محلول الإيلاستين المعلق مثل محلول البولي ببتيد هو جهاز طرد مركزي لإزالة الملوثات غير القابلة للذوبان.

يتم الاحتفاظ بالإيلاستين القابل للذوبان مثل البولي ببتيد في المادة الطافية ويتم التخلص من الحبيبات. تسمى هذه الخطوة بالدوران البارد ، وتكرار دورات الدوران الساخن والبارد حتى يتم تحقيق نقاء مرض للإيلاستين مثل البولي ببتيد. في النهاية ، ينتج عن دورة الانتقال العكسي الإيلاستين النقي مثل منتجات البولي ببتيد التي يمكن تمييزها للاستخدام في مجموعة متنوعة من التطبيقات الطبية الحيوية.

يحتوي الإيلاستين مثل عديد الببتيدات المنقى بهذه التقنية على عدد من التطبيقات المفيدة ، بما في ذلك الاستشعار الحيوي وهندسة الأنسجة وتوصيل الأدوية ، حيث يمكن ضبط درجة حرارة الانتقال وبنية البوليمر الحيوي للإيلاستين مثل البولي ببتيد على وجه التحديد لكل تطبيق. للبدء ، عبر عن بلازميد ترميز ELP المطلوب في الإشريكية القولونية باستخدام الشروط الموضحة في بروتوكول النص المصاحب. بعد هز مزرعة لتر واحد في حاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، انقل المزرعة إلى زجاجة طرد مركزي سعة لتر واحد ، ثم قم بالطرد المركزي للزجاجة عند 2000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية والريسوس. قم بتعليق الحبيبات في ماء PBS أو أي مخزن مؤقت آخر مرغوب فيه إلى حجم إجمالي قدره 45 ملليلترا. ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ضع تعليق الخلية على الجليد وبمجرد تبريد صوتي لمدة تسع دقائق في دورات مدتها 10 ثوان و 20 ثانية. بقدرة خرج 85 واط. اسمح للعينة لتبرد على الجليد لمدة 10 دقائق تقريبا بعد الجولة الأولى من الصوتنة ، ثم كرر دورة الصوتنة لمدة تسع دقائق.

انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 50 مل. ثم أضف ملليلترين من 10٪ وزن لكل حجم من البولي إيثيلين لكل لتر من الثقافة ، وقم بهز الأنبوب لخلطه بعد ذلك ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 16 ، 000 GS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع نظيف سعة 50 مليلتر وتخلص من الحبيبات.

أضف كلوريد الصوديوم البلوري إلى العينة للحث على انتقال ELP. بمجرد ذوبان الملح ، سيتحول المحلول إلى غائم ، مما يشير إلى فصل طور ELP عن المحلول. ثم قم بتكسير ELP عن طريق الطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 GS لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، قد تظهر حبيبات ELP معتمة في البداية ، وتتخلص من المادة الطافية ، ثم تضيف من واحد إلى خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المطلوب بعد التبريد. قد تبدو حبيبات ELP شفافة وبنية اللون. يقوم Resus بتعليق الحبيبات عن طريق سحب الأنبوب أو تدويره عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك، قم بإدخال مخطط واحد من محلول ELP المعلق في أنابيب طرد مركزي دقيقة نظيفة سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب عند 16،000 GS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف وتخلص من الكريات.

تحفيز انتقال ELP مع إضافة كلوريد الصوديوم. إذا كان ELP يحتوي على درجة حرارة انتقال عالية لا يمكن إحداثها بالملح وحده ، فقم باحتضان العينة على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أعلى من درجة حرارة انتقال ELP. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 GS لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أعلى من درجة الحرارة المستخدمة في خطوة انتقال ELP.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات ELP في 500 إلى 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت المطلوب عن طريق سحب الأنبوب أو تدويره عند أربع درجات مئوية حتى يتم إعادة إذابة الحبيبات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 GS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتحبيب أي ملوثات غير قابلة للذوبان. ثم انقل snat إلى أنبوب نظيف وتخلص من الحبيبات كرر دورة الانتقال العكسي حتى لا يتم ملاحظة أي بيليه ملوث.

وهذا يتطلب عادة من دورتين إلى خمس دورات. قم بإعداد سلسلة تخفيف من حلول ELP في PBS أو أي مخزن مؤقت آخر مطلوب. ثم استخدم مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية التي يتم التحكم في درجة حرارتها لقياس الكثافة الضوئية عند 350 نانومتر على مدى مجموعة من درجات الحرارة أثناء تسخين العينة بمعدل درجة مئوية واحدة في الدقيقة.

إذا لم تظهر أي زيادة في الكثافة البصرية ، فقد تتجاوز درجة حرارة الانتقال الحد الأقصى لدرجة الحرارة. بعد ذلك ، قم بقياس الانخفاض في الكثافة الضوئية على نفس نطاق درجات الحرارة بمعدل تبريد يبلغ درجة مئوية واحدة في الدقيقة. للتحقق من انعكاس مخطط انتقال ELP ، الكثافة البصرية مقابل درجة الحرارة ، ثم تحديد درجة الحرارة الانتقالية لبوليمر homo ELP.

من خلال تحديد نقطة الانعطاف في ملف تعريف التعكر هذا ، يتم تأكيد التنقية الناجحة ل LPs بواسطة صفحة SDS كما يمكن رؤيته هنا. عدد الملوثات أكبر بكثير في محللة الإشريكية القولونية الأولية مقارنة بالعينة بعد جولة واحدة من دورة الانتقال العكسي. تتميز درجة حرارة انتقال ELP بالتعكر المبرمج بدرجة الحرارة لبوليمر ELP homo.

ملف تعريف التعكر زيادة حادة واحدة في الكثافة الضوئية ، والتي تحدد درجة حرارة الانتقال عند تركيز معين. يتم تأكيد الطبيعة العكسية لانتقال ELP من خلال مسح تعكر التبريد. تظهر البوليمرات المشتركة لكتلة قوالب ELP ملف تعريف تعكر أكثر تعقيدا من LPs البوليمر البشري.

يمكن بعد ذلك إجراء قياسات تشتت الضوء الديناميكي لتأكيد سلوك LPs التي يتم استنتاجها من ملف ملف تعريف التعكر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الإيلاستين المؤتلف مثل عديد الببتيدات من الإشريكية القولونية باستخدام دورة الانتقال العكسي. لا لا لا لا لا.