Name: ارتفاع العائد تنقية المتصورة المنجلية Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: تعلم تنقية الميروزويتات الحية من المتصورة المنجلية باستخدام E64 والفصل المغناطيسي لدراسة بلعمة الخلايا بواسطة مقياس التدفق الخلوي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على قياس الأجسام المضادة البلعمية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب نود أن نعترف الأطفال والجهات المانحة البلازما الكبار، والموظفين في بابوا غينيا الجديدة معهد للأبحاث الطبية. فإن الكتاب أود أن أشكر أماندين B Carmagnac، كاثرين س نيه، داني ويلسون W، ايفو مولر وديانا S هانسن لمساهمتهم في تطوير هذه التقنية، وأشكر الصليب الأحمر الأسترالي لحزم الدم والمصل. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال الفيكتوري حكومة الولاية التنفيذية البنية التحتية ودعم الحكومة الأسترالية NHMRC IRIISS. وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ويمنح # 1031212 # 637406 و، والمعاهد الوطنية للصحة منح AI089686 #.

<ol><li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li>
<li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFowkes%2C+FJI+%22PLoS+Medicine%22">PLoS Medicine</a>. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).</li>
<li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro%2C+but+act+in+cooperation+with+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li>
<li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).</li>
<li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li>
<li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li>
<li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li>
<li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72(2007).</li>
<li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li>
<li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li>
<li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte%3A+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li>
<li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li>
<li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li>
<li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li>
<li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+immunity+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Ataíde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152(2010).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li>
<li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li>
<li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li>
<li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li>
<li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li>
<li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li>
<li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonopsonic+monocyte%2Fmacrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes%3A+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

لقياس أقسومة البلعمة، والكفاءة في اثنين من التقنيات المطلوبة: تنقية merozoites وTHP-1 البلعمة الفحص. أهم الخطوات الحاسمة لدمج هذه التقنيات هما: 1) الطفيليات متزامنة للغاية؛ 2) إضافة E64 في الوقت الصحيح لانتاج الغشاء merozoites المغلقة؛ 3) إزالة هيموزوين لتجنب الركام؛ 4) عد أقسومة دقة من قبل التدفق الخلوي؛ 5) التخفيف من البلازما المستخدمة؛ و6) الحفاظ على كثافة خلايا انخفاض عدد ومرور THP-1 الخلايا. ودراسة متأنية لهذه الجوانب الرئيسية لوحظ ضمان استجابات قوية البلعمة. وعلى الرغم من وصفها هنا هو إعداد merozoites لتقييم البلعمة، ويمكن استخدام هذه التقنية لمجموعة واسعة من التطبيقات. بغض النظر عن منهجية تيار أسفل، الاستعدادات أقسومة الأمثل تعتمد على توقيت E64 بالإضافة إلى ذلك بشكل صحيح من أجل توليد merozoites. وقد تبين طريقة E64 الموصوفة هنا إلى ذدرع merozoites الغازية للاستخدام في ارتفاع القرار المجهري للأحداث الغزو وفحوصات الحساسية المخدرات 15-20. بينما الجدوى أقسومة ليست ضرورية لالبلعمة، مطلوب سلامة معطف سطح أقسومة. وبالتالي فإن أسلوب E64 الموصوفة هنا يسمح merozoites عالية الجودة التي يتم إنتاجها لتقييم استجابات الأجسام المضادة إلى معطف السطح. كما هو مبين في الشكل 1، إذا تم إضافة E64 في وقت مبكر جدا أو لا تتشكل بعد فوات الأوان غشاء merozoites المغلقة. لهذا السبب، هناك حاجة الثقافات الطفيلي متزامن للغاية. هنا، واستخدام العلاجات السوربيتول والهيبارين لبإحكام مزامنة D10-GFP الثقافات الطفيلي إلى نافذة من 2 ساعة يوصف. الهيبارين يمكن أن تعزز gametocytogenesis في مختبر أخرى يعزل، وبالتالي يجب أن تستخدم بعناية. طرق تزامن البديلة مثل ألانين يمكن أن تستخدم أيضا، شريطة أن الطفيليات متزامنة بإحكام ويتم إنتاج 29. إذا تم إضافة E64 للطفيليات غير متزامنة، دعامة أقلوسيتم إنتاج ortion من merozoites المغلقة الغشاء وإصابة الطفيلي المتبقية سوف RBC إما تمزق عادة أو تطوير التشكل غير طبيعي. فإن وجود الطفيليات التي لم تتطور في الغشاء المغلقة merozoites يؤدي إلى انسداد الفلتر والحد بشكل كبير من العائد أقسومة الحصول عليها. خلال الترشيح من merozoites المغلقة الغشاء، هيموزوين يتحرر من فجوات الهضمي وبوصفها بلورات الحرة في الحل. هيموزوين هو proinflammatory للغاية وتم الإبلاغ لتعديل الوحيدات البلاعم والبلعمة الردود 30 و 31. بالإضافة إلى تحوير البلعمة، كما هو مبين في الشكل 2، ويمكن تشكيل المجاميع هيموزوين مع merozoites في الحل. كما THP-1 الخلايا يمكن يبلعم هذه المجاميع، وهذا يمكن أن يكون المحير الرئيسية لقرار من الأجسام المضادة بوساطة البلعمة. لذلك، إزالة هيموزوين ضروري في هذا الاختبار لAVتعقيد إضافي OID من هيموزوين على بلعمية علم الأحياء. بالإضافة إلى ذلك، عدم إزالة هيموزوين قد تكون ضارة أيضا عند استخدام هذه التقنية لتوليد merozoites الحرة لتطبيقات أخرى، وخاصة التي تتطلب أقسومة الكمي. كما هو مبين في الشكل (4)، وأضاف أن عدد merozoites إلى مقايسة يمكن أن تؤثر على درجة من البلعمة من قبل THP-1 الخلايا. على الرغم من التدفق الخلوي يسمح لتعداد تركيز أقسومة، pipetting لدقيق وتكرار التهم من merozoites ضرورية لتحسين الدقة. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا إذا الطفيلي خطوط متعددة هي لفحصها جنبا إلى جنب. وقد سبق أن ثبت أن البلازما من نصف الأطفال في مأمن من PNG يمكن أن تضعف بشكل كبير قبل الانخفاض الردود 23. الموصوفة هنا هو التخفيف الأمثل من البلازما (1/120، 000 التخفيف النهائي من البلازما) لفيف من 5 - الأطفال PNG من العمر 12 سنة التي أنتجت مجموعة كبيرة من phagocyt. ردود عمليات التفتيش الموقعي هو موضح في الشكل 5 هذا النطاق المسموح به لالطبقية من الردود إلى أربع مجموعات (0-19٪، 20 - 39٪، 40-59٪ و60-79٪ البلعمة)، وكشفت النمذجة الانحدار أن الاستجابات opsonizing ارتبطت الحماية من المرض السريري وجود الطفيليات في الدم عالية الكثافة 10 للفوج يدرس مختلفة قد يكون من الضروري لضبط التخفيف البلازما لضمان البلعمة من قبل THP-1 الخلايا لا غير المشبعة أو دون مستوى الكشف. التدفق الخلوي يسمح البلعمة سريعة وقابلة للقياس الكمي مع تحسين دقة أكثر المجهري. هذا البروتوكول هو إنتاجية عالية، لوحة ومقرها الآلي اقتناء 96 لوحات جيدة لدراسة المكتسبة طبيعيا الحصانة الخلطية. يتطلب أسلوب تلطيخ مع بروميد إيثيديوم merozoites والبقع الحمض النووي ولكن البديلة مثل SYBRgreen، دابي وpropidium اليود والبقع أو البقع غشاء البروتين يمكن الاستفادة منها. سيكون هذا الاختبار تكون قابلة للPRIMARذ حيدات أو العدلات، ويمكن تكييفها إذا كان بلعمية أو FCR بيولوجيا الفائدة. الخلايا الأولية أو THP-1 خلايا متباينة في المختبر مع سلطة النقد الفلسطينية يمكن استخدامها لدراسة البلعمة في الملاريا ومسببات الأمراض الأخرى 12، 32-34. ومع ذلك باستخدام الخلايا الأولية قد تكون صعبة حيث أن هذه الخلايا هي ملتصقة وعرض غير الأجسام المضادة بوساطة البلعمة 35 أيضا. بالإضافة إلى ذلك، تقلب في الطهارة، والسلامة وظائف بعض القيود الرئيسية لاستخدام الخلايا البلعمية الأولية. المستقبلات التيسير المشاركة في أقسومة البلعمة تبقى uncharacterized، وبالتالي يمكن منع استخدام الأجسام المضادة لمستقبلات محددة التيسير توضيح مساهمة كل التيسير مستقبلات لأقسومة البلعمة. كما THP-1 البلعمة هو FCR تعتمد، وهذا يتيح تفسير واضحة من البلعمة ملاحظتها. هذا الاختبار يفسح المجال أيضا لمعالجة خصوصية المستضد من الأجسام المضادة التي opsonizing يمكن تحقيقه عن طريق UTILizing الطفيليات خروج المغلوب لمستضدات سطح أقسومة، أو باستخدام تقارب الأجسام المضادة البشرية النقية لأقسومة البروتينات السطحية. علاوة على ذلك، دراسات متعمقة الردود خلوى التالية أقسومة البلعمة تعاني من نقص، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام هذا الاختبار. هذه التقنيات اثنين تشكل تقدما كبيرا لدراسة الأجسام المضادة antimerozoite الوظيفية. تنقية merozoites جودة عالية هو مفيد لاستخدام merozoites cryopreserved، أو المجهرية الفلورسنت المغلفة مع مستضدات أقسومة. على الرغم من أن هذا الاختبار قد تم استخدامه كأداة لتقييم المناعة المكتسبة طبيعيا، فإنه قد يثبت أداة هامة لمعالجة اكتساب الحصانة ردا على التطعيم. في حين أنه ثبت مؤخرا أن البلعمة أو merozoites opsonised يرتبط مع حماية من الملاريا السريرية، وأنه ليس من الممكن التوصل إلى استنتاجات مباشرة من في المختبر THP-1 البلعمة لفي الجسم الحي phagocytoجهاز الأمن والمخابرات من merozoites كما البلعمة في هذا الاختبار يحدث في ظل ظروف ثابتة وغياب خلايا الدم الحمراء المتنافسة. وبالتالي قد التعديلات المحتملة لهذا الاختبار توفير أداة مرنة لمزيد من فهم الملاريا وأقسومة البلعمة.

وقد تبين أهمية الأجسام المضادة للمناعة ضد الملاريا المنجلية قبل 40 عاما، عندما المناعي من البالغين مفرط المناعة نقلت بشكل سلبي على الأطفال الذين يعانون من الملاريا الحادة مما أدى إلى التخفيف من حدة المرض 1. بالتالي، سعت جهدا كبيرا لتحديد أهداف الحصانة ملاريا وقائية، معظمها من خلال قياس الأجسام المضادة لالتتر الببتيدات أو البروتينات أعرب البكتريا بواسطة ELISA. وقد ثبت الأمصال ELISA يستند أيضا متغير بدرجة كبيرة بين الدراسات، ولا يتناول وظيفة الأجسام المضادة 2. العديد من المستضدات الملاريا لحث على IgG1 أليف الخلايا والأجسام المضادة IgG3 الشخصي، وخاصة المستضدات السطحية أقسومة 3. يوحي هذا التحيز فرعية أن الأجسام المضادة مستقبلات FC-(FCR) التفاعلات مع البالعات مهمة لوظائف المستجيب من opsonizing الأجسام المضادة antimerozoite 4. صممت عدة لقاحات أقسومة مستضد قيد التطوير لانتزاع ظائف المستجيب بلعمية 5 و 6 و على الرغم من الأدلة الهامة لأهمية التفاعلات الأجسام المضادة FCR في نماذج من القوارض الملاريا موجود 7-9، ودعم عدد قليل من الدراسات التي أجريت مؤخرا على أهمية الأجسام المضادة وظيفية وظائف بلعمية المستجيب للحصانة لالملاريا في البشر 10، 11، لا تزال هذه المنطقة المدروسة على نحو رديء. وقد تم دراسة الأجسام المضادة في opsonizing محددة أقسومة محدودة من قبل اثنين من العوامل؛ صعوبة في عزل merozoites نوعية جيدة؛ والاستجابات البلعمة متغير من الخلايا الأولية. حتى وقت قريب، واستخدمت الطرد المركزي عالية السرعة أو الكثافة Percoll تدرجات لعزل merozoites من supernatants ثقافة تمزق الثقافات المتقسمة. كانت هذه merozoites نادرا ما قابلة للحياة، وغالبا ما تتلاعب مزيدا من الكثافة الطرد المركزي ويغسل متعددة الخطوات من 12، أو 11 الحفظ بالتبريد قبل استخدامها في المقايسات. هذه بروكesses يحتمل فصل العديد من البروتينات المرتبطة محيطيا من سطح أقسومة والبروتينات المعروف أن أهداف الأنتيجين الحصانة ملاريا 13. مؤخرا السيستين مثبط البروتياز عبر Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 الغوانيدينو) البوتان (E64) وقد استخدمت لتوليد merozoites قابلة للحياة. E64 يمنع تمزق المتقسمة، وتوليد غشاء المغلقة merozoites 14، والتي يمكن أن تتعطل عن طريق الترشيح لتحرير merozoites قابلة للحياة 15 و 16. وقد تؤدي هذه التقنية إلى القرار المكانية من خلال العديد من البروتينات كرات الدم الحمراء الغزو 15، 17-19، وتوضيح تأثير مرحلة معينة من الأدوية المضادة للملاريا عدة 16 و 20. ومع ذلك، فإن جيل من merozoites قابلة للحياة لا يزال تحديا تقنيا. للمساعدة في نشر هذه التقنية وتطبيقها لالمقايسات الفنية الحصانة، بروتوكول مفصلة لتنقية أقسومة قابلة للحياة واستخدامها فييوصف التعاون الخلوية في طهاية والبلعمة هنا: مقايسة وظيفية موحدة من الأجسام المضادة. يوضح هذه التقنية تقدما كبيرا خلال فحوصات في المختبر السابقة من أقسومة طهاية، مثل انفجار العدلات الجهاز التنفسي، والأجسام المضادة التابعة الخلوية تثبيط (ADCI)، وفحوصات أقسومة البلعمة البديلة. هذه هي المقايسات استنساخه سيئة بسبب التباين في مدخلات الطفيلي ونشاط الخلايا البلعمية الابتدائي 11، 21. قد تلويث هيموزوين أيضا تؤثر تأثيرا عميقا بلعمية وظيفة 22. وذكرت مؤخرا قوية وقابلة للتكرار أقسومة البلعمة مقايسة 23 يستخدم خط الخلية promonocytic THP-1 24. هذا هو نوع من الخلايا مثالية لفحوصات التدفق الخلوي إنتاجية عالية كما هو غير ملتصقة ويؤدي FC-مستقبلات بوساطة البلعمة 25 و 26 على وجه التحديد. على تعقيد إضافي بينما التحرياتtigating البلعمة هو أن درجة البلعمة يعتمد على عدد من merozoites نسبة إلى THP-1 الخلايا وتركيز البلازما. لضمان استنساخ التجارب بين، merozoites يجب أن يكون تعداد وتركيز المعرفة المستخدمة. نظرا لصغر حجمها، وتدفق مطلوب الكمي cytometric. الإجراء الموضح هنا يزيل هيموزوين ويولد merozoites قابلة للحياة، ويصف تطبيق هذه merozoites لتدفق cytometric تعداد merozoites تليها طهاية والبلعمة. على الرغم من أن تطلبا من الناحية الفنية، والأساليب المذكورة قد تكون مفيدة في توضيح مساهمة استجابات الأجسام المضادة المحددة لسطح أقسومة المكتسبة طبيعيا واللقاح بفعل الحصانة.

<table><tbody><tr><td>THP-1 خط الخلية</td><td>الأمريكية نوع الثقافة مجموعة</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>مصل عجل الجنين (FCS)</td> <td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapthoethanol &nbsp ؛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>استخدام في</td></tr><tr><td>قلم الدخان / محلول البكتيريا العقدية (100x)</td> <td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>درجة ثقافة الخلايا</td></tr><tr><td>هيبوكسانثين</td><td>كالبيوكيميوم</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>مصل بشري &nbsp ؛</td><td>تبرع من الصليب</td><td></td> الأحمر الأسترالي <td>متوفر تجاريا (أي Invitrogen)</td></tr> <tr><td>بيكربونات الصوديوم (NaHCO3)</td> <td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Pfizer</td><td>61022027</td><td>جودة الحقن</td></tr><tr><td>هيبارين الصوديوم BP (5000 وحدة دولية / مل)</td> <td>Pfizer</td><td></td><td>من أصل الخنازير</td></tr><tr><td>Blasticidin S-hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 مثبط البروتياز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>استخدم لمخزن الفوسفات</td></tr><tr><td>Na 2HPO4.2H20</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>استخدم للمخزن المؤقت للفوسفات</td></tr> محلول <tr><td>الأزور يوزين الميثيلين الأزرق من Giemsa</td><td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>1:10 التخفيف في 6.7 mN عازلة الفوسفات (اصنع كل بقعة جديدة)</td></tr> <tr><td>ملح ثنائي الصوديوم</td><td>EDTA Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M ، درجة الحموضة 7.2</td></tr> مرشحات <tr><td>حقنة Acrodisc 1.2-& mu ؛ م / 32 مم</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr> فاصل <tr><td>QuadroMACS (للعمود الصغير)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>قابل للتبديل مع MidiMACS & nbsp ؛</td></tr><tr><td>فاصل VarioMACS (للأعمدة الكبيرة)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS Column (عمود مغناطيسي صغير)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>عمود مغناطيسي كبير</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Bio-Rad</td><td>1510433</td> العد <td>السام للخلاياحبات</td></tr><tr><td>العد المطلق الساطع</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSمقياس التدفق الخلوي للكاليبور مع قارئ لوحة HTS</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA ملح ثنائي الصوديوم</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 م ، درجة الحموضة 7.2</td></tr><tr><td>برنامج تحليل القياس الخلوي FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

المتصورة المنجلية مستضدات أقسومة قيد التطوير لقاحات الملاريا المحتملة. جانب واحد من الحصانة ضد الملاريا هو إزالة merozoites خالية من الدم من قبل خلايا البلعمة. ومع ذلك تقييم فعالية وظيفية معينة من الأجسام المضادة opsonizing أقسومة يمثل تحديا بسبب القصير نصف عمر merozoites وتباين الخلايا البلعمية الأولية. وصفت بالتفصيل في هذه الوثيقة هو وسيلة لتوليد merozoites قابلة للحياة باستخدام مثبط البروتياز E64، ومقايسة من أقسومة تعتمد طاهية-البلعمة باستخدام خط خلية موالية للالوحيدات THP-1. E64 يمنع تمزق المتقسمة بينما يسمح للتطوير merozoites التي تم إصدارها عن طريق الترشيح من schizonts المعالجة. وopsonized merozoites بروميد إيثيديوم المسمى مع عينات البلازما البشرية، وأضاف إلى THP-1 الخلايا. ويتم تقييم البلعمة بواسطة بروتوكول إنتاجية عالية موحدة. merozoites قابلة للحياة هي موردا قيما لتقييم NUMERجوانب من الأوس P. البيولوجيا المنجلية، بما في ذلك تقييم الوظيفة المناعية. وترتبط مستويات الأجسام المضادة يقاس هذا الاختبار مع الحصانة السريرية لمرض الملاريا في الأفراد المعرضين بشكل طبيعي. قد يكون الفحص أيضا من استخدام الأجسام المضادة لتقييم اللقاح التي يسببها.

مرحلة نضوج الطفيليات قبل العلاج E64 هو أمر حاسم لتوليد merozoites المغلقة الغشاء. يبين الشكل 1Ai مرحلة النضج المناسبة من schizonts لإضافة E64. يجب أن تكون الطفيليات الكبيرة وملء ما يقرب من خلايا الدم الحمراء. A مظهر أرقط من بالغيمزا صمة عار يشير بدأت نماء جزئي، وينبغي أن يضاف E64 لانتاج merozoites المغلقة غشاء (الشكل 1Aii). إذا تم إضافة E64 في وقت سابق إلى أتروفة الطفيليات المرحلة، لا يتم إنشاء غشاء merozoites المغلقة حتى بعد 12 ساعة من E64. بدلا الطفيليات تأخذ على التشكل غير طبيعية مثل توسيع فجوة في الجهاز الهضمي (الشكل 1Bi و1Bii)، وليس تتشكل merozoites. إذا تم إضافة E64 في وقت لاحق إلى schizonts، لا يتم إنشاء merozoites المغلقة الغشاء كما هو يحتاطون المتقسمة تمزق (الشكل 1Ci و1Cii). مطلوب مستوى عال من الطفيليات التزامن، وغيرهاسيتبين الحكمة مجموعة من جميع النتائج الثلاث المذكورة بعد العلاج E64. إزالة هيموزوين هو خطوة حاسمة أخرى لتنقية merozoites. إذا لم يتم تنقيته من merozoites هيموزوين ثم تشكيل مجموعات-أقسومة هيموزوين التي لا يمكن فكها من قبل pipetting. هذه المجاميع تعمل على عداد الكريات كأحداث واحد، وإن كان ذلك مع مختلف الأمام ومبعثر والجانب مبعثر من الخصائص merozoites واحد، مما أدى إلى عد أقسومة غير دقيقة من قبل التدفق الخلوي (الشكل 2A). كما THP-1 الخلايا يمكن أيضا يبلعم هيموزوين، هذه المجموعات أقسومة-هيموزوين يمكن أيضا المبتلعة (الشكل 2B). هذه المجاميع هي الفلورسنت EtBr للغاية لأنها تحتوي على merozoites متعددة. البلعمة من نتائج المجاميع في THP-1 الشخصي EtBr مضان يعادل ذلك الذي لوحظ لالبلعمة من merozoites فردية متعددة. وبالتالي، إذا لم يتم إزالة هيموزوين، فإن مضان EtBr من THP-1 الخلايا يكون سverestimate من إمكانات لopsonizing البلازما التي يجري اختبارها. وتفيد التقارير أيضا إلى هيموزوين يغير كثيرا ظيفة بلعمية. هي ملطخة merozoites إيجابية GFP مواجهة مع EtBr لزيادة التصور من merozoites المبتلعة من قبل THP-1 الخلايا. باستخدام الظروف الموصوفة في هذا البروتوكول، وcounterstained جميع merozoites GFP إيجابية مع EtBr التي لديها كثافة مضان أكثر إشراقا (الشكل 3A). تقييم البلعمة من قبل EtBr مضان يتيح دقة فائقة من أقسومة البلعمة من GFP مضان (الشكل 3B). فإن عدد merozoites تضاف إلى فحص تعدل كمية البلعمة ملاحظتها. لهذا السبب، العد دقيقة بواسطة التدفق الخلوي أمر بالغ الأهمية. زيادة نسب merozoites: سوف THP-1 يؤدي إلى زيادة التزام merozoites لTHP-1 الخلايا في غياب البلازما (الشكل 4A). زيادة أقسومة: THP-1 نسب النتائج أيضا إلى زيادة درجة الحموضةردود agocytosis عندما يتم opsonized merozoites (الشكل 4B). 4:1 أقسومة: ينصح THP-1 نسبة للاستجابات أكلة قوية. باستخدام هذه النسبة، والتخفيف من البلازما المشار إليها، هذا الاختبار هو قادرة على حل مستويات منخفضة ومتوسطة وعالية من الأجسام المضادة opsonizing. وقد لوحظت بين 0 و 78 في المئة الردود البلعمة باستخدام PNG عينات البلازما وغيرها من الشروط وصفها. وتظهر هذه الاستجابات مؤخرا لاقترانه المكتسبة طبيعيا الحصانة السريرية لمرض الملاريا 10. ويبين الشكل 5 أمثلة من 4 الربعية الردود البلعمة من الأفراد PNG. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. توقيت E64 بالإضافة إلى ذلك أمر بالغ الأهمية لتوليد merozoites المغلقة الغشاء. (A) maturatio المناسبةلا يتم إنشاء ن مرحلة من الطفيليات ط) قبل العلاج E64، والثاني) merozoites المغلقة غشاء إنتاجها بعد 6 ساعة من العلاج E64 (B) غشاء merozoites المغلقة إذا تم إضافة E64 للطفيليات غير ناضجة؛ ط) النواشط المرحلة المتأخرة، والثاني) بعد 12 ساعة من E64 (لا تحول دون C) المتقسمة تمزق إذا تم إضافة E64 إلى أواخر schizonts مجزأة؛ ط) schizonts المرحلة المتأخرة، والثاني) بعد 6 ساعة من E64. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. إزالة هيموزوين أمر بالغ الأهمية لتوليد تعليق أقسومة وحيدة الخلية. الشكل المجاميع أقسومة-هيموزوين التالية الترشيح من الغشاء merozoites المغلقة، ما لم يتم فصل هيموزوين مغناطيسيا من merozoites. (A) إلى الأمام، مبعثر والجانبية مبعثر المؤامرات من merozoites مع هيموزوين إزالةواحتفظ هيموزوين. (B) المجاميع هيموزوين أقسومة يمكن المبتلعة من قبل THP-1 الخلايا. ملطخة فرق-خيارات الشرائح خلوي تدور من THP-1 الخلايا المحتضنة مع بابوا نيو غينيا البلازما opsonized الاستعدادات أقسومة مع أو بدون هيموزوين. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. يسمح إيثيديوم بروميد تلطيخ لدقة فائقة من أقسومة البلعمة. يتم counterstained D10-GFP merozoites المنقى مع EtBr لتحسين كثافة مضان (أ) التدفق الخلوي histrogram من merozoites المنقى مع تبوب على merozoites إيجابية GFP، وصمة عار نقطة تظهر EtBr مضان GFP في هذا مسور السكان إيجابية. (B) مبعثر إلى الأمام مقابل GFP ومبعثر إلى الأمام مقابل EtBr من THP-1 خلايا البلعمة التالية من GFP وEtBr merozoites الفلورسنت مزدوجة. ود بوابات<html> rawn استنادا إلى خلايا THP-1 مع merozoites وأي سيطرة البلازما. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4 أقسومة: THP-1 نسبة يؤثر على درجة من البلعمة ملاحظتها. (أ) خمسة أقسومة: وصفت THP-1 النسب؛ 50:1، 20:01، 10:01، 04:01، 1:1. الخلايا السيطرة فقط يشير مضان الخلفية بسبب THP-1 الخلايا. يشار THP-1 EtBr مضان لكل نسبة لmerozoites opsonized مع مجموعة من PNG البلازما أو البلازما مع الاسترالي nonimmune (B) متوسط ​​كثافة مضان THP-1 للخلايا أقسومة مختلفة:. THP-1 النسب، و opsonization مع بركة من PNG البلازما أو البلازما الاسترالية nonimmune (يعني + ووزارة شؤون المرأة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. هناك مجموعة كبيرة من الأجسام المضادة opsonizing يمكن قياسها. تم opsonized Merozoites مع البلازما من الأفراد PNG وحضنت مع THP-1 الخلايا. يتم عرض أربعة ردود البلعمة ممثل. ووضعت بوابات استنادا إلى خلايا THP-1 مع merozoites وأي سيطرة البلازما، والأرقام تشير إلى البلعمة٪ بعد الطرح من الخلايا THP-1 مع التحكم في البلازما غير المناعي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

قياس وظيفة الأجسام المضادة هو المفتاح لفهم حصانة لالملاريا المنجلية. يصف هذا الأسلوب تنقية merozoites قابلة للحياة، وقياس تعتمد على طهاية البلعمة من قبل التدفق الخلوي.

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج ميروزويتات (merozoites) نقية من طفيل الـ plasmodium falciparum بإنتاجية عالية لتقدير كمية عملية الطلاء المناعي (opsonization) لها بواسطة الأجسام المضادة البشرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيط تمزق الشيزونتات (schizonts) باستخدام E 64 لتوليد تراكيب ميروزويتات محاطة بغشاء. وفي الخطوة الثانية، يتم حصاد الميروزويتات الحرة ثم صبغها بـ AUM bromide للتقدير الكمي، وفي الخطوة النهائية، يتم تحضين الميروزويتات مع عينات مختلفة من البلازما البشرية وخلايا THP 1 وحيدة النواة البشرية.في النهاية، يمكن التمييز بين عملية الطهية (opsonization) لـ maites بواسطة عينات بلازما بشرية مختلفة باستخدام قياس التدفق الخلوي. وتكمن مزايا هذه التقنية مقارنة بالمقايسات الحالية للمناعة الوظيفية ضد malaria meite في استخدام mes سليمة، كما أن استجابات البلعمة تكون قوية وقابلة للقياس الكمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال مناعة الملاريا، مثل: ما أهمية الأجسام المضادة المؤكسدة والبلعمة في تحقيق المناعة ضد الملاريا لدى الأفراد الذين تلقوا اللقاح أو المعرضين لها بشكل طبيعي؟تعد معاينة هذه التقنية أمراً بالغ الأهمية لأن توقيت إضافة E 64 أساسي لضمان تكوين mezo. ونظراً لأن تحضير mezo وتعداده يتطلبان دقة تقنية عالية، فبعد الفصل المغناطيسي لـ P falciparum Trophozoites في مراحلها المتأخرة، يتم تقييم نضج الطفيليات عن طريق تثبيت مسحة رقيقة من الطفيليات في 100% methanol لمدة 10 ثوانٍ وتلوينها بـ Giza لمدة ثلاث دقائق. تُفحص الشريحة الملونة تحت المجهر للتأكد من أن الطفيليات تملأ خلايا الدم الحمراء تقريباً وتبدو في مرحلة early zen.إذا لم تكن الطفيليات قد وصلت إلى مرحلة النضج المناسبة، فاستمر في تحضينها حتى تتطور بشكل ملائم. وبمجرد نضجها بشكل مناسب، عالج الشيزونت (schizont) المعزولة بـ 10 micromolar من E 64 وحضنها لمدة تتراوح من ست إلى 10 ساعات أخرى. بعد التحضين باستخدام E 64، قم بإعداد لطخة من الطفيليات المعالجة.قم بتثبيت الشريحة في 100% methanol وصبغها بصبغة Giza للتأكد من أن 50% على الأقل من الطفيليات قد شكلت غشاءً. قم بطرد كريس المتبقي المعالج بـ E 64 مركزاً لمدة ثماني دقائق عند 1900 Gs في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الطفيليات في 50 milliliters في درجة حرارة الغرفة.اغسل العينة بوسط الغسيل لإزالة أي مصل بشري متبقٍ. بعد التخلص من الطافي، أعد تعليق كتلة الطفيليات في 2 mL من وسط الغسيل، ثم قم بترشيح معلق الخلايا عبر مرشح حقنة بمسامية 1.2 micrometer، مع تجميع المايتات وبلورات الهيمون في أنبوب سعة 10 mL. بعد ذلك، قم بتثبيت عمود مغناطيسي صغير بمغناطيس ووازنه باستخدام 500 µL من وسط THP one.مرر الراشح عبر العمود المغناطيسي ثلاث مرات مع جمع الـ maites في السائل المتدفق في كل مرة. ثم اشطف العمود بمقدار 2 mL من وسط THP في درجة حرارة الغرفة لجمع أي maites متبقية.تعد إزالة الهيمين خطوة حاسمة لتنقية المايتات. فإذا لم يتم فصل المايتات عن الهيمين، ستتشكل تكتلات من المايتات والهيمين، مما يؤدي إلى عدم دقة في عد المايتات بواسطة قياس التدفق الخلوي. وبما أن خلايا THP-1 يمكنها بلعمة الهيمين، فإن تكتلات المايتات والهيمين يمكن أن يتم بلعمتها أيضاً.وبالتالي، إذا لم تتم إزالة الهيمين، فسيتم المبالغة في تقدير إمكانات الطلاوة للبلازما التي يتم اختبارها أيضاً. قم بصبغ المايتات المجمعة في 10 micrograms per milliliter من بروميد ahy في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. بعد 30 دقيقة، قم بطرد المايتات مركزياً، وتخلص من السائل الطافي في حاوية نفايات مناسبة، واغسل كُتلة المايتات في أربعة milliliters من وسط THP one pellet maites.بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا في 15 milliliters من وسط TP one مع حمايتها من الضوء. ولتقدير كمية maites باستخدام قياس التدفق الخلوي، قم بعدّ maites عند تخفيفات 1 في 100، و1 في 50، و1 في 25.أولاً، قم بتوزيع 940 و930 و910 µL من محلول PBS مضافاً إليه BSA في ثلاثة أنابيب fax مختلفة، ثم أضف 10 و20 و40 µL من maites المنقاة إلى كل أنبوب على التوالي. بعد ذلك، قم برج خرزات العد (counting beads) الموجودة في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز vortex لمدة 30 ثانية، ثم أضف 50 µL من هذه الخرزات إلى كل أنبوب fax يحتوي على maites المخففة. قم بتحليل عينات maite المخففة الثلاث على جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer) مجهز بليزر 488 nm، مع تعيين بوابة صارمة لـ maites بناءً على بوابة الفلورة المزدوجة لـ atherium bromide وGFP، وتخصيص الخرزات في قناة منفصلة، واستمر في جمع الأحداث حتى يتم تجميع 2000 خرزة.لتقدير عدد المايتات (maites) عند كل تخفيف، يتم حساب متوسط قياسات تركيز المايتات الثلاثة. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق المايتات بتركيز 8 × 10⁶ مایت/مل في وسط THP-1 لضمان نسبة نهائية تبلغ 4 مايتات لكل خلية THP-1 لقياس عملية البلعمة للمايتات. أولاً، يتم تجميع عدد كافٍ من خلايا THP-1 اللازمة للمقايسة، ثم إعادة تعليقها بتركيز 6.7 × 10⁵ خلية/مل في وسط THP-1.بعد ذلك، أضف 150 µL من خلايا THP-1 بمعدل بئر واحد لكل حالة سيتم اختبارها، مكررة ثلاث مرات، إلى لوحة 96 بئر ذات قاع على شكل حرف U ومسدودة بـ FCS، بتركيز نهائي يصل إلى 10⁵ خلية لكل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة حتى يحين وقت إضافة المايتات. ثم أضف 150 µL من المايتات المعزولة بتركيز 8 × 10⁶/mL إلى لوحة 96 بئر منفصلة ذات قاع على شكل حرف U ومسدودة بـ FCS، بمعدل بئر واحد لكل حالة سيتم اختبارها.أضف 10 µL من عينات البلازما المخففة والمجهزة إلى كل بئر من آبار maites مع الخلط جيداً لضمان الحصول على محلول متجانس. بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول بلازما maite إلى كل بئر من آبار صفيحة THP one في ثلاث مكررات لكل عينة بلازما يتم اختبارها. اخلط العينات جيداً، ثم قم بحضن المزارع المشتركة مغطاة في حاضنة رطبة عند 37 °C في 5% carbon dioxide.بعد مرور 40 دقيقة، قم بطرد العينات مركزياً في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقاً لإيقاف عملية البلعمة. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول fax buffer بارد جداً (في درجة حرارة الجليد)، وبعد الغسلة الثانية، قم بتثبيت الخلايا في 90 microliters من مثبت fax fixative واتركها على الجليد.يُحفظ بعيداً عن الضوء حتى مرحلة الاستحواذ. تُعد مرحلة نضج الطفيليات قبل المعالجة بـ E 64 أمراً بالغ الأهمية لتوليد المايتات المحاطة بغشاء. يجب أن تكون الطفيليات كبيرة الحجم، بحيث تملأ خلية الدم الحمراء تقريباً، وتظهر تلوناً منقطاً بالـ gems.ستؤدي إضافة E 64 في هذه المرحلة إلى إنتاج maites محاطة بغشاء بعد التحضين لمدة تتراوح بين ست إلى 10 ساعات. أما إذا أضيفت E 64 في مرحلة مبكرة إلى الطفيليات في طور التروفوزويت (trophozoites)، فلن تتكون maites محاطة بغشاء. وفي حال إضافة E 64 في مرحلة متأخرة، فإن عملية تمزق schon لن يتم تثبيطها.يتطلب الأمر مستوى عالياً من التزامن الطفيلي. وخلاف ذلك، ستظهر مجموعة من النتائج الثلاث الموصوفة بعد المعالجة بـ E 64؛ حيث يتيح قياس البلعمة باستخدام فلورة بروميد الأكومين دقة فائقة في رصد بلعمة الطفيليات مقارنة بفلورة GFP وحدها. كما يؤدي زيادة نسبة الـ maites إلى خلايا THP-1 إلى زيادة التصاق الـ maites بخلايا THP-1.في حالة عدم وجود أجسام مضادة نوعية لـ maite، يؤدي زيادة نسبة MEITE إلى خلايا THP-1 أيضاً إلى زيادة في البلعمة بنسبة تتراوح بين 0 و 78%. وقد لوحظ حدوث عملية الطلاوة لـ maites باستخدام عينات بلازما من بابوا غينيا الجديدة عند نسبة 4 إلى 1 من MAITE إلى خلايا THP-1. تظهر هذه البيانات أمثلة على الأرباع الأربعة لاستجابات PHA الحمضية من أربعة أفراد ممثلين من بابوا غينيا الجديدة. وقد ثبت أن الأجسام المضادة المساعدة على الطلاوة التي تم قياسها باستخدام هذا المقايسة ترتبط بالمناعة السريرية ضد الملاريا عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء.تتمثل النقاط الرئيسية التي يجب تذكرها لضمان نجاح عملية البلعمة في الحصول على طفيليات شديدة التزامن للحصول على ميروزويتات ناضجة تماماً وسليمة، والحفاظ على مزارع خلايا THP-1 بشكل مناسب. يمكن تطويع تقنية تنقية الميروزويتات الموضحة في هذا الإجراء لأي تطبيق يتطلب ميروزويتات ملاريا عالية الجودة، مثل اختبارات التعرف، أو الغزو، أو المقاييس البروتينية، أو المصلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام طريقة E 64 لتنقية الميروزويتات والتحقيق في الأجسام المضادة المسهلة للبلعمة عن طريق قياس البلعمة بواسطة خلايا THP-1.

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

هذا الأسلوب يحقق في النمط الظاهري تكتل الصفائح الدموية...

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

يوضح هذا الفيديو مقايسة البلعمة القائمة على قياس التدفق الخلوي التي تتضمن كريات الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية المصنفة والمصابة بالبصيلة بواسطة الخلايا الوحيدة. يحدد قياس التدفق الخلوي التألق في الخلايا الوحيدة ، مما يؤكد التحديد الناجح لكريات الدم الحمراء المنحلة من خلال البلعمة.

اختبار لقياس البلعمة بوساطة الأجسام المضادة لكريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات

وتستخدم خصائص ممغطس من هيموزوين لعزل المراحل المتأخرة...

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

التعبير عن البروتينات ملاريا في نظم الخلايا استنادا يظل تحديا. علينا أن نبرهن خطوتين واحد IVT خطوة (في الترجمة المختبر) نظم خلايا حرية التعبير للتعبير عن الملاريا البروتينات المقيرع المؤتلف من خلايا هيلا. ونحن نستخدم نظام تنقية أساس ني راتنج تقارب لتنقية البروتينات المقيرع.

نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن<em&gt; المتصورة</em&gt; المقيرع البروتينات

تنتقل microRNAs البشرية من كريات الدم الحمراء المضيفة إلى طفيليات المتصورة المنجلية. هنا ، يتم وصف التقنيات المستخدمة لنقل microRNAs الاصطناعية إلى كريات الدم الحمراء المضيفة وعزل جميع الحمض النووي الريبي من P. falciparum.  بالإضافة إلى ذلك ، ستفصل هذه الورقة طريقة لعزل متعدد الجمرات في المتصورة المنجلية لتحديد شغل الريبوسومات وإمكانات الترجمة لنصوص الطفيليات.

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير تعليمات حول كيفية قياس قدرة الأجسام المضادة الموجودة في سيرا أو البلازما للأفراد ، المعرضين بشكل طبيعي لعدوى بالسيباروم البلازمودي ، لopsonize والحث على البلعميات الحمراء المصابة بالطفيليات (IEs).

قياس المكتسبة بشكل طبيعي Phagocytosis-تحريض الأجسام المضادة لبلاموديوم فالسيباروم الطفيليات من قبل تدفق Cytometry القائم على المقايسة

يصف هذا البروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش للكشف عن سبوروزويتات الغدد اللعابية في البعوض. وباستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة بسهولة، تتيح هذه الطريقة الكشف الفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية عن البعوض الذي يحمل المتصورة المنجلية أو المتصورة النشيطة. وهذه الطريقة مناسبة لبحوث انتقال الملاريا، بما في ذلك مسوحات النواقل.

الكشف عن المتصورة Sporozoites في بعوض الأنوفيليس باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم

يعتبر فحص التغذية الغشائية القياسي (SMFA) المعيار الذهبي لتقييم وتحديد المركبات المحتملة المضادة للملاريا. يستخدم نظام التغذية الاصطناعي هذا لإصابة البعوض لمواصلة تقييم آثار هذه المركبات على شدة وانتشار طفيلي المتصورة المنجلية .

فحص التغذية الغشائية القياسية للكشف عن عدوى المتصورة المنجلية في نواقل البعوض الأنوفيليس

نصف هنا طريقة جديدة للمساعدة في توضيح آليات المناعة الخلوية للبلازميوم خلال مرحلة الدم من العدوى. هذا اختبار في المختبر يقيس قتل خلايا الدم الحمراء المصابة بواسطة الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا.

في المختبر فحص خلايا الدم الحمراء المصابة بالبلازموديوم التي تقتلها الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا

تعلم تنقية الميروزويتات الحية من المتصورة المنجلية باستخدام E64 والفصل المغناطيسي لدراسة بلعمة الخلايا بواسطة مقياس التدفق الخلوي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على قياس الأجسام المضادة البلعمية بدقة.

ارتفاع العائد تنقية

استكشف المزيد من الفيديوهات