جيل وتنقية الإنسان INO80 ونين إعادة عرض مجمعات وSubcomplexes

الهدف من هذا الإجراء هو إنشاء وتنقية النوع البري والإصدارات المتحولة من الوحدة الفرعية المتعددة في مجمع إعادة تشكيل الكروماتين 80. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل النوى أولا عن الخلايا التي تعبر عن حاتمة العلم الموسومة ببروتينات O 80 في الخطوة الثانية ، يتم تحضير المستخلصات النووية ، ثم يتم تنقية النوع البري أو الإنسان المتحور في مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين O 80 بواسطة كروماتوغرافيا مضادة للعلم. في النهاية ، يمكن تحليل تركيبات الوحدات الفرعية لمجمعات NO 80 المنقاة عن طريق اللطخة الغربية أو تلطيخ الفضة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية مساهمة الوحدات الفرعية لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين MultiPro في نشاطها العام. تم تصميم هذه الطريقة خصيصا لدراسة النوع البري والإصدارات الطافرة من مجمع NO 80 Chromatin Remodeling ، ولكن يمكن استخدامها أيضا لدراسة المجمعات النووية الأخرى متعددة الوحدات الفرعية. مثل الوسيط.

الأكثر أهمية في الإجراء هي خطوة الاستخراج النووي. عادة ما يواجه الناس مشكلة لأنه أثناء خطوة استخراج الملح ، يميل الناس إلى إضافة الملح بسرعة كبيرة أو بقوة كبيرة بعد الثقافة في زجاجات الأسطوانة ، انقل خلايا HEC 2 9 3 إلى أنبوب مخروطي متدرج بحجم مناسب وقم بتدويرها لمدة 10 دقائق عند 1000 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية. بعد إزالة supinate ، قم بقياس حجم حبيبات الخلية المعبأة ، ثم أعد تعليق الحبيبات في خمسة أحجام من خلايا العبوة A مع ماصة لطيفة واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق بالضبط.

بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، قم بقياس حبيبات الخلية مرة ثانية ، يجب أن يزداد حجمها إلى ضعف حجمها. هذه المرة ، أعد تعليق الخلايا في حجمين من خلايا العبوة من المخزن المؤقت A ثم انقل تعليق الخلية إلى خالط الأنسجة السفلي بحجم مناسب وقم بتجانس تعليق الخلية باستخدام المدقة الزجاجية السائبة حتى تلطخ 90٪ من الخلايا بشكل إيجابي باستخدام جهاز طرد مركزي أزرق ثلاثي ، الخلايا المتجانسة في أنبوب طرد مركزي عالي السرعة سعة 45 مليلتر لمدة 20 دقيقة عند 25 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية في دوار بزاوية ثابتة. ثم قم بإزالة SUP natant الذي يحتوي على بروتينات العصارة الخلوية من الحبيبات النووية لاستخراج النوى بالملح.

أضف الآن 2.5 مل من المخزن المؤقت C ، ولكن كل ثلاثة ملليلتر من حجم الخلية المعبأة إلى الحبيبات. ثم باستخدام ماصة مصلية ، قم بإزاحة الحبيبات من جدار الأنبوب ونقل الخليط بالكامل إلى الخالط السفلي بالحجم المناسب. قم بتجانس الخليط بضربتين من مدقة فضفاضة لتعليق النوى ثم نقل الجزء النووي nu المعلق إلى دورق مبرد بحجم بحيث يملأ التعليق الدورق بعمق لا يقل عن 0.5 سم.

بعد ذلك، احسب حجم خمسة كلوريد صوديوم مولي ضروري ليصل المحلول إلى تركيز نهائي قدره 0.42 مولي كلوريد الصوديوم وفقا للصيغة التالية. الآن أضف تدريجيا محلول الملح المحسوب قطرة قطرة مع تمييز التعليق برفق بقضيب زجاجي على الجليد لزيادة تركيز الملح في المعلق حتى تتم إضافة كلوريد الصوديوم بالكامل ويصبح المحلول لزجا جدا. ثم قم بنقل التعليق اللزج بعناية إلى أنابيب بولي كربونات سعة 70 مليلتر في دوار من النوع 45 TI مع مجموعة غطاء واستخدم مطفرا لهز الأنابيب المختومة ببطء عند أربع درجات مئوية بعد 30 دقيقة ، قم بعمل طرد مركزي فائق العينات في دوار TI 45 لمدة 30 دقيقة عند 40 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية ، واسحب المستخلص النووي الذي يحتوي على المواد الطافية في وعاء بلاستيكي واحد.

ثم قسم محلول المستخلص النووي إلى حصص ذات حجم مناسب ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتحضير Anti-Flag aros لتنقية المناعة، ابدأ باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع قطع الطرف لنقل 200 ميكرولتر على ملاط حبة مضاد للعلم بنسبة 50٪ إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. انقل الخرزات المغسولة مسبقا إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 10 مل من المستخلص النووي المذاب حديثا قبل ساعات من أربع درجات مئوية مع دوران بطيء على دوار مختبري ، ثم اجمع العلم عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق من 1000 مرة جم وأربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اغسل مستخلص الخرزة P في 10 ملليلتر من القمل ، وأربعة 50 عازلة لمدة خمس دقائق من أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف على محول. ثم بعد تدوير خليط مستخلص الخرزة ، أعد استخدامه مرة أخرى. قم بتعليق الحبيبات في 100 إلى 150 ميكرولتر من القمل الطازج أربعة 50 ، وانقل الخرزات إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل.

الاستمرار في شطف الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر بسعة 100 إلى 150 ميكرولتر من Lysol 50 حتى يتم نقل جميع الخرزات إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. بعد تدوير الخرزات في جهاز طرد مركزي صغير ، اغسلها ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من lys four 50 ومرة واحدة بمليلتر واحد من EB 100. ثم لتصفية البروتينات المرتبطة ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB 100 الذي يحتوي على ببتيد العلم واحتضان العينة عند أربع درجات مئوية على الجوز.

بعد نصف ساعة ، قم بتكسير الخرزات في جهاز الطرد المركزي الصغير الذي تكتسبه ثم انقل SUP natant الذي يحتوي على مركب OAC C المغطى به إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. بعد تكرار elucian أربع مرات أخرى ، قم بتمرير المسحوب المسحوبة عبر عمود دوران فارغ لإزالة أي حبات هوائية متبقية من جزء البروتين. أخيرا ، استخدم جهاز ترشيح فائق الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 50،000 لتركيز جزء البروتين المشار إليه حوالي 10 أضعاف.

كما هو موضح في هذا الشكل ، يمكن تقييم نقاء مجمعات NO 80 المحضرة باستخدام الوحدات الفرعية لعلامة العلم المشار إليها ، كما هو موضح للتو ، باستخدام المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد الملونة بالفضة. أي بروتينات تظهر في ممر التحكم هذا هي ملوثات ترتبط بشكل غير محدد بعلم الأيروس. تشير هذه الملصقات إلى الحظر المقابل للوحدات الفرعية NO 80 التي تم اختبارها ، وتشير هذه إلى تحركات علامات الوزن الجزيئي.

يشار إلى موضع النوع البري رقم 80 بالمربع الأسود ، ويشار إلى مواقع الطفرات رقم 80 بالدوائر المفتوحة. الممرات التي يفصلها الخط الأسود هي من مواد هلامية منفصلة. يمكن تقييم تكوين المجمعات بواسطة Western blott باستخدام الأجسام المضادة ضد وحدات فرعية مختلفة NO 80.

على سبيل المثال. فيما يلي الوحدات الفرعية لوحدة المجال الطرفي النهائي ، وتم تقييم الوحدة النمطية المرتبطة بمركز Helicase ووحدة SNF الثانية. بمجرد إتقانها ، يمكن الانتهاء من هذه التقنية في غضون يوم واحد ، بدءا من حصاد الخلايا وانتهاء بتنقية المجمعات.

ستسمح هذه التقنية للباحثين بتنقية المجمعات والمجموعات الفرعية متعددة الوحدات لخلايا الثدييات من أجل دراسة وظائفها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم أفضل لكيفية تنقية إعادة تشكيل الكروماتين ومجمعات البروتين متعددة الوحدات الفرعية الأخرى من الخلايا البشرية أو خطوط خلايا الزخم الأخرى.