فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

الهدف من الإجراء التالي هو قياس الأنشطة الكيميائية الحيوية المختلفة لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على TP. يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس الانزلاق المعتمد على TP لنيوكليوسوم الموضع من أحد طرفي جزيء الحمض النووي إلى موضع أكثر مركزية على الحمض النووي باستخدام مقايسة تحول الحركة الكهربائي أو emsa. يمكن استخدام طريقة مماثلة قائمة على EMSA لمراقبة تكوين مناطق أحادية النواة المعقدة المرتبطة بإعادة تشكيل لتقييم نشاط ربط النيوكليوسوم لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة لقياس نشاط APAs لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على TP. في النهاية ، يمكن استخدام هذه الطرق لقياس إعادة تشكيل الكروماتين المعتمد على TP للإنسان في مجمعات O 80. في هذا الفيديو ، سنوضح المقايسات الكيميائية الحيوية التي تدرس مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين NO 80.

يمكن أيضا تطبيق طريقة مماثلة لدراسة مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين الأخرى أيضا لإجراء مقايسة إعادة تشكيل النيوكليوسوم المعتمدة على TP. قم أولا بإعداد ركائز النيوكليوسوم بعد إعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 100 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري ثم قم بتمرير نواتج التفاعل مرتين عبر أعمدة الدوران الحرة للنوكلياز لإزالة أي نيوكليوتيدات غير مدمجة.

بعد ذلك ، قم بخلط اثنين من P 32 المسمى 6 0 1 شظايا DNA مع ستة ميكروغرامات من نيوكليوسومات الهيلار في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت ، واحتضان الخليط عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتخفيف الخليط بالتتابع إلى 0.8 مولار و 0.6 مولي و 0.4 مولي كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر و 20.8 ميكرولتر و 41.6 ميكرولتر على التوالي من محلول المخزن المؤقت tris HCL المكمل ب E-D-T-A-P-M-S-F و DTT لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية بعد كل إضافة ، بعد الحضانة الأخيرة عند 125 ثم 250 ميكرولتر من محلول هيدروكلوريد tris. كما تم استكماله ب P 40 الجلسرين غير المدين و PSA في تخفيفين آخرين ، 30 دقيقة ، 30 درجة مئوية إلى 0.2 مولار و 0.1 مولي كلوريد الصوديوم على التوالي.

ثم قم بتخزين الركيزة أحادية النواة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر قبل إعداد المقايسات المصبوبة بالمواد الهلامية الأصلية بولي أكريلاميد. ثم لكل تفاعل يتم إجراؤه ، اجمع حوالي 20 نانومولار في oh 80 مع الكمية المناسبة من المخزن المؤقت EB 100 الكافية لإعطاء حجم 4.75 ميكرولتر في السيليكون المبرد مسبقا. أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 ملليلتر يعيد تجميد أي كسور متبقية NO 80 تحتوي على كسور ، ومسحوق الثلج الجاف.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 5.25 ميكرولتر من الكوكتيل الرئيسي الطازج على كل أنبوب تفاعل ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم احتضان التفاعلات في كتلة حرارية 30 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، أضف 1.5 ميكرولتر من مزيج الإزالة الطازج إلى كل أنبوب لإنهاء التفاعلات ، ثم امزج كل أنبوب تفاعل.

قم بتدويرها جيدا واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. وفي الوقت نفسه ، قم بتشغيل جل بولي أكريلاميد الأصلي مسبقا في وحدة الرحلان الكهربائي الرأسي عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، باستخدام 0.5 XTBE كمخزن مؤقت للتشغيل مع قضيب تحريك مغناطيسي داخل الغرفة السفلية للحفاظ على دوران عازل ثابت في نهاية الحضانة مع إزالة المزيج ، امزج 2.5 ميكرولتر من قالب التحميل مع كل تفاعل. وبعد دوران قصير ، استخدم نصائح التحميل لتحميل العينات على الجل.

قم بتشغيل الجل عند 200 فولت لمدة 4.5 ساعة عند أربع درجات مئوية مع دوران عازل. ثم انقل الجل إلى كومة من ورقتين من ورق الترشيح وقم بإسقاط مرشحات الورق مع الجل في الأعلى باستخدام غلاف بلاستيكي شفاف لاكتشاف الإشارة. قم بتعريض الجل لشاشة تخزين فوسفو عند أربع درجات مئوية للوقت المطلوب ، ثم امسح الشاشة باستخدام نظام ماسح ضوئي لتصوير النظائر وقم بتحليل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لإجراء فحوصات APAs المعتمدة على الحمض النووي والنيوكليوسوم.

ابدأ بدمج 10 إلى 50 نانومولار من المجمعات الفرعية المنقاة المناعية مع كمية من eeb 100 buffer كافية لإعطاء حجم 2.2 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مشحم مسبقا سعة 1.5 مليلتر لكل تفاعل ، ثم أعد تجميد أي NO 80 يحتوي على أجزاء في مسحوق الثلج الجاف. ثم امزج برفق 2.8 ميكرولتر من الكوكتيل الفرعي الطازج الذي يحتوي على نيوكليوسومات الحمض النووي أو لا يحتوي على أي منها مع أنابيب تفاعل تحتوي على إنزيم مع سحب لأعلى ولأسفل وانقل الأنابيب إلى كتلة حرارية 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم قلم رصاص لرسم خط خفيف جدا لا يقل عن 1.5 سم من الحافة السفلية لبولي إيثيلين 20 × 10.

أعني كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو لوحة TLC. ثم ضع 0.5 ميكرولتر من كل خليط تفاعل على الخط عند 5 و 15 و 30 و 60 دقيقة بعد الحضانة ، مع إعادة كل عينة على الفور إلى الكتلة الحرارية ، بحيث يمكن أخذ نقاط زمنية متعددة من أنبوب واحد. بعد تطبيق العينة الأخيرة ، استخدم مجفف الشعر لتجفيف اللوحة ثم انقل اللوحة إلى حجرة زجاجية تحتوي على ما يكفي.

0.375 مولار فوسفات البوتاسيوم للسماح بغمر الجزء السفلي من 0.5 سم من صفيحة TLC في المحلول. قم بتغطية الغرفة وتطوير التفاعل حتى يصل الجزء الأمامي من الطور السائل إلى الجزء العلوي من لوحة TLC ، وعند هذه النقطة يجب تجفيف اللوحة على الفور وتعريضها لشاشة فوسفو للتخزين في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بمسح الشاشة باستخدام نظام ماسح ضوئي للتصوير بالنظائر لتحديد كمية الركيزة المشعة TP ومنتج DP.

توضح هذه التجربة الأولى أن المركب يتم تنقية من خلال علم IES اثنين من العلم ، N-O-A-T-E والعلم رقم 80 دلتا N لهما أنشطة انزلاق نيوكليوسوم مماثلة مما يشير إلى أن نهاية NO 80 N و / أو الوحدات الفرعية المرتبطة بها يمكن الاستغناء عنها لإعادة تشكيل النيوكليوسوم بواسطة مركب NO 80. في المقابل ، يتم تنقية المركب من خلال العلم NO 80 دلتا n دلتا HSA غير نشطة في هذا الفحص ، مما يشير إلى أن نشاط إعادة التصميم يعتمد على مجال HSA ل NO 80 APAs و / أو الوحدات الفرعية المرتبطة بها. باستخدام تعديل إجراء الفحص المنزلق NUCLEOSOME ، يمكن للمرء قياس نشاط ربط النيوكليوسوم لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين.

في هذه التجربة ، أدى حضانة النيوكليوسومات بكميات متزايدة من مجمعات NO 80 السليمة المنقاة من خلال الوحدة الفرعية NO 80 E إلى اختفاء الشريط المعتمد على الجرعة المقابل لمناطق أحادية النوى الحرة وظهور نوع متحول جديد هاجر بالقرب من الجزء العلوي من الجل. في المقابل ، بينما تم تحضين النيوكليوسومات بمجمعات أصغر تم تنقيتها من خلال NO 80 delta N والتي تفتقر إلى مجموعة فرعية من NO 80 وحدات فرعية ، هاجرت الأنواع المنقولة بسرعة أكبر مما يشير إلى أن الحركة النسبية للنطاق الفائق التحول يتم تحديده من خلال حجم مقايسة المجمعات. في هذه التجربة النهائية ، يتم عرض نتائج الاختبار الذي يقارن أنشطة APAs المنشطة بالحمض النووي والنيوكليوسوم لمعقدين فرعيين مختلفين NO 80.

تتوافق البقع الأكثر هجرة البطيئة مع بداية alpha 32 P المسماة TP ، والأنواع الأكثر سرعة هي منتجات تفاعل A DP مع المناطق التي تشير إلى اتجاه هجرة المذيبات. أثناء استخدام هذه الإجراءات ، من المهم أن تتذكر إجراء فحوصات تختلف في طول الفترة الزمنية وتحتوي على تركيزات مختلفة من الإنزيم. سيضمن ذلك أخذ القياسات عندما تكون منحنيات استجابة وقت المنتج والجرعة خطية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل أنشطة ربط النيوكليوسوم في TPAs وأنشطة انزلاق النيوكليوسوم لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين المنقى. لا تنس أن العمل مع المواد المشعة يمكن أن يكون خطيرا. يجب على المرء اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر ومراقبة حماية العين للتلوث الإشعاعي والتخلص من النفايات المشعة بشكل صحيح.