فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

يهدف الإجراء التالي إلى قياس الأنشطة الكيميائية الحيوية المختلفة لمعقدات إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على TP. ويتم تحقيق ذلك من خلال قياس انزلاق النوكليوزوم المعتمد على TP من أحد طرفي جزيء DNA إلى موضع أكثر مركزية على DNA باستخدام مقايسة إزاحة الحركية الكهربائية أو emsa. ويمكن استخدام طريقة مماثلة تعتمد على EMSA لمراقبة تكوين مناطق أحادية النوكليوزوم المرتبطة بمعقد إعادة التشكيل لتقييم نشاط ارتباط النوكليوزوم بمعقدات إعادة تشكيل الكروماتين.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة لقياس نشاط APAs في معقدات إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على TP. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الطرق لقياس إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على TP في معقدات O 80 البشرية. سنقوم في هذا الفيديو بشرح المقايسات البيوكيميائية لدراسة معقدات إعادة تشكيل كروماتين NO 80.

يمكن تطبيق طريقة مماثلة أيضاً لدراسة معقدات إعادة تشكيل الكروماتين الأخرى، ولإجراء مقايسة إعادة تشكيل النوكليوسوم المعتمدة على TP. أولاً، قم بتحضير ركائز النوكليوسوم بعد إعداد تفاعل PCR بحجم 100 microliter كما هو موضح في الجدول. قم بإجراء تفاعلات PCR في جهاز التدوير الحراري، ثم مرر نواتج التفاعل مرتين عبر أعمدة طرد مركزي خالية من النوكلياز لإزالة أي نوكليوتيدات غير مدمجة.

بعد ذلك، اخلط 2 pmol من قطع DNA 601 الموسومة بـ P 32 مع 6 µg من النوكليوسومات الرابطة (hilar nucleosomes) في 50 µL من المحلول المنظم، واحضن الخليط عند 30 °C لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتخفيف الخليط تسلسلياً إلى تركيز 0.8 M و0.6 M و0.4 M من كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 12.5 µL و20.8 µL و41.6 µL على التوالي من محلول Tris-HCl المنظم المدعم بـ EDTA وPMSF وDTT، مع الاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 30 °C بعد كل إضافة، ثم بعد الاحتضان الأخير أضف 125 µL ثم 250 µL من محلول Tris-HCl المنظم. المدعم أيضاً بـ glycerol غير مستهلك P 40 وPSA في تخفيفين إضافيين لمدة 30 دقيقة عند 30 °C للوصول إلى تركيز 0.2 M و0.1 M من كلوريد الصوديوم على التوالي.

بعد ذلك، يتم تخزين ركيزة النيوكليوزوم الأحادي عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر قبل إعداد المقايسات وصب هلامات البولي أكريلاميد الأصلية. بعد ذلك، ولكل تفاعل سيتم إجراؤه، يتم دمج حوالي 20 nM من NO 80 مع الكمية المناسبة من محلول EB 100 المنظم بما يكفي للحصول على حجم 4.75 µL في أنبوب طرد مركزي دقيق سيلكوني سعة 1.5 mL مبرد مسبقاً. يتم تجميد أي أجزاء متبقية تحتوي على NO 80 فوراً باستخدام الثلج الجاف المسحوق.

بعد ذلك، وزع 5.25 µL من المزيج الرئيسي (master cocktail) المُحضّر حديثاً في كل أنبوب تفاعل، مع الخلط جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة. ثم حضن التفاعلات في كتلة تسخين عند درجة حرارة 30 °C. وفي نهاية فترة التحضين، أضف 1.5 µL من مزيج الإيقاف (removing mix) المُحضّر حديثاً إلى كل أنبوب لإنهاء التفاعلات، ثم اخلط كل أنبوب تفاعل.

سنقوم بطردها مركزياً ثم تحضينها عند 30 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة أخرى. وفي هذه الأثناء، يتم التشغيل المسبق لهلام بولي أكريلاميد الطبيعي (native poly acrylamide gel) في وحدة ترحيل كهربائي عمودية عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة Celsius، باستخدام 0.5 XTBE كمحلول منظم للتشغيل مع وضع قضيب تحريك مغناطيسي داخل الغرفة السفلية للحفاظ على دوران مستمر للمحلول المنظم. وفي نهاية فترة التحضين، يتم إخراج الخليط ومزج 2.5 µL من صبغة التحميل مع كل تفاعل. وبعد عملية طرد مركزي قصيرة، تُستخدم رؤوس التحميل لتحميل العينات على الهلام.

قم بتشغيل الهلام عند 200 فولت لمدة 4.5 ساعة في درجة حرارة أربع درجات مئوية مع تدوير المحلول المنظم. بعد ذلك، انقل الهلام إلى مجموعة مكونة من ورقتين من ورق الترشيح، ثم قم بتغطية أوراق الترشيح مع الهلام في الأعلى باستخدام غلاف بلاستيكي شفاف للكشف عن الإشارة. عرّض الهلام لشاشة فوسفورية للتخزين في درجة حرارة أربع درجات مئوية للمدة المطلوبة، ثم افحص الشاشة باستخدام نظام ماسح ضوئي لتصوير النظائر وحلل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لإجراء مقايسات APA المعتمدة على DNA والنيوكليوزوم.

ابدأ بدمج 10 إلى 50 nanomolar من المجمعات الفرعية المنقاة مناعيًا مع كمية من محلول eeb 100 buffer كافية للحصول على حجم 2.2 µL في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL مبرد مسبقًا ومزيت لكل تفاعل، ثم قم فورًا بإعادة تجميد أي كسور تحتوي على NO 80 في ثلج جاف مسحوق. بعد ذلك، امزج برفق 2.8 µL من كوكتيل فرعي محضر حديثًا يحتوي على DNA nucleosomes أو لا يحتوي عليها مع أنابيب التفاعل التي تحتوي على الإنزيم عن طريق السحب والدفع بالمصاصة، وانقل الأنابيب إلى كتلة تسخين بدرجة حرارة 30 °C. بعد ذلك، استخدم قلم رصاص لرسم خط خفيف جدًا على بُعد 1.5 cm على الأقل من الحافة السفلية لورقة polyethylene بمقاس 20 × 10.

أقصد كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو لوح TLC. بعد ذلك، يتم وضع بقع بحجم 0.5 µL من كل خليط تفاعل على الخط عند 5 و15 و30 و60 دقيقة بعد الحضن، مع إعادة كل عينة فوراً إلى الكتلة الحرارية، بحيث يمكن أخذ نقاط زمنية متعددة من أنبوب واحد. وبعد وضع العينة الأخيرة، استخدم مجفف شعر لتجفيف اللوح، ثم انقل اللوح إلى غرفة زجاجية تحتوي على كمية كافية.

فوسفات البوتاسيوم بتركيز 0.375 molar للسماح بغمر الـ 0.5 centimeters السفلية من لوحة TLC في المحلول. غطِّ الحجرة واترك التفاعل يتطور حتى تصل جبهة الطور السائل إلى أعلى لوحة TLC، وعند هذه النقطة يجب تجفيف اللوحة فوراً بالنفخ وتعريضها لشاشة فسفورية للتخزين في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، قم بمسح الشاشة باستخدام نظام ماسح لتصوير النظائر لتحديد كمية ركيزة a TP المشعة وناتج a DP.

توضح هذه التجربة الأولى أن المركب الذي تم تنقيته عبر flag IES two flag، وN-O-A-T-E، وflag NO 80 delta N يمتلكون أنشطة مماثلة في إزاحة النيوكليوسومات، مما يشير إلى أن الطرف النيتروجيني (N terminus) لـ NO 80 و/أو الوحدات الفرعية المرتبطة به ليست ضرورية لإعادة تشكيل النيوكليوسومات بواسطة مركب NO 80. في المقابل، فإن المركبات التي تم تنقيتها عبر flag NO 80 delta n delta HSA تكون غير نشطة في هذا المقايسة، مما يشير إلى أن نشاط إعادة التشكيل يعتمد على نطاق HSA في NO 80 APAs و/أو الوحدات الفرعية المرتبطة به. وباستخدام تعديل في إجراء مقايسة إزاحة النيوكليوسومات، يمكن قياس نشاط ارتباط النيوكليوسومات لمركبات إعادة تشكيل الكروماتين.

في هذه التجربة، أدى تحضين النيوكليوسومات مع كميات متزايدة من معقدات NO 80 السليمة التي تم تنقيتها عبر الوحدة الفرعية NO 80 E إلى اختفاء نطاق النيوكليوسومات الأحادية الحرة بشكل يعتمد على الجرعة، وظهور نوع جديد مزاح هاجر بالقرب من أعلى الهلام. وفي المقابل، عندما تم تحضين النيوكليوسومات مع معقدات أصغر تم تنقيتها عبر NO 80 delta N والتي تفتقر إلى مجموعة فرعية من وحدات NO 80 الفرعية، فقد هاجر النوع المزاح بشكل أسرع، مما يشير إلى أن الحركية النسبية للنطاق المزاح للغاية تتحدد بحجم معقدات المقايسة. وفي هذه التجربة النهائية، يتم عرض نتائج مقايسة تقارن أنشطة APAs المنشطة بواسطة DNA والنيوكليوسومات لمعقدين فرعيين مختلفين من NO 80.

تتوافق البقع ذات الهجرة الأبطأ مع alpha 32 P labeled a TP البادئ، بينما تمثل الأنواع ذات الهجرة الأسرع نواتج تفاعل A DP، حيث تشير المساحات إلى اتجاه هجرة المذيب. وأثناء استخدام هذه الإجراءات، من المهم تذكر إجراء مقايسات تتفاوت في مدتها الزمنية وتحتوي على تركيزات مختلفة من الإنزيم؛ وذلك لضمان إجراء القياسات عندما تكون منحنيات الاستجابة للزمن والجرعة الخاصة بالناتج خطية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحليل أنشطة ربط النوكليوسوم وانزلاق النوكليوسوم في معقدات إعادة تشكيل الكروماتين المنقاة عند TPAs. لا تنسَ أن العمل مع المواد المشعة يمكن أن يكون خطيراً؛ لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معطف المختبر وواقي العينين، ومراقبة التلوث الإشعاعي، والتخلص من النفايات المشعة بشكل صحيح.