الجيل المقبل من الأنسجة ميكروأري (ngTMA) بروتوكول للدراسات العلامات البيولوجية

الهدف من الإجراء التالي هو بناء المصفوفات الدقيقة المثلى أو المستهدفة للأنسجة للاستخدام اللاحق في أبحاث المؤشرات الحيوية. أولا ، يتم إنشاء أرشيف شرائح رقمي من شرائح الأنسجة التمثيلية. يتم شرح مجالات الاهتمام النسيجية على الشرائح الرقمية لتحديد المناطق الدقيقة للكتل المانحة المقابلة التي سيتم نقلها إلى كتلة الأشعة المجهرية للنسجة.

بعد إنشاء تصميم المصفوفات الدقيقة للأنسجة وتخطيطاتها ، يتم تثقيب الكتل المانحة تلقائيا ويتم تحميل السبب في المصفوفات الدقيقة للأنسجة. باستخدام نهج الجيل التالي الدقيق والسريع والآلي هذا ، يمكن التقاط المناطق النسيجية الدقيقة أو حتى مجموعات معينة من الخلايا بدقة ونقلها إلى مصفوفة دقيقة للأنسجة. من الواضح أن الميزة الرئيسية لتقنيتنا على الطرق الحالية لحلقة الأنسجة الدقيقة ، مثل استخدام جهاز محلي الصنع أو شبه آلي ، هي الدقة النسيجية.

يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين نقاط القوة في علم الأمراض الرقمي والخبرة النسيجية وأيضا الحلقة الدقيقة للأنسجة الآلية التي توضح الإجراء اليوم هي كالين هامان وخوسيه جالفان. مساعدتان فنيتان من مختبرنا باستخدام برنامج المسح. حدد أولا الوضع التلقائي لمسح المجال الساطع.

ثم انقر فوق خيارات المسح الضوئي لضبط معلمات جودة الشريحة. اختر الآن حفظ عمليات مسح الشرائح محليا أو إلى إنهاء الويب بالنقر فوق معلمات الخادم وتعيين وجهة الفحص إلى مركز الحالة. الآن ، قم بإعداد الشرائح قبل تحميل الشرائح في المجلة بالنسبة للماسح الضوئي ، تأكد من نظافة الشرائح.

إذا لزم الأمر ، قم بتنظيفها باستخدام الإيثانول ، يمكن تحميل ما يصل إلى 25 شريحة في كل مجلة ويمكن تحميل الماسح الضوئي بما يصل إلى 10 مجلات. يتم تكديس المجلات المتعددة عند تحميلها. بمجرد تحميل الشرائح ، أعط جميع الشرائح وأسماء الملفات وقم بتعيين مجلد الحفظ في مركز الحالة.

ابدأ الآن في مسح الشريحة بالنقر فوق السهم الأخضر. في هذا القسم ، يتم تعيين المواقع التي يتم من خلالها تثقيب عينات الأنسجة على الشريحة عن طريق التعليقات التوضيحية على الشريحة الرقمية. ابدأ بفتح مجلد الشرائح الرقمية.

في برنامج العرض ، يمكن إجراء تغييرات على المجلد نفسه. يمكن إضافة الملاحظات ، ويمكن إعادة ترتيب الشرائح ، ويمكن تعيين امتيازات المستخدم مثل المرفقات. ابدأ الآن في التعليق على الشرائح بالنقر فوق إحداها.

سيظهر في العارض. في العارض. استخدم أداة التكبير لتقييم الشريحة والعثور على مجالات الاهتمام للتكامل في الجيل التالي من TMA.

باستخدام أداة التعليق التوضيحي TMA، حدد حجم النواة المطلوبة ولون التعليق التوضيحي. قم بإرفاق هذا التعليق التوضيحي بشريحة بالنقر فوق الشريحة. ثم انقل التعليق التوضيحي إلى الهياكل النسيجية المطلوبة.

تحدد هذه التعليقات التوضيحية مواقع الثقب على كتلة الأنسجة المقابلة. كرر هذه العملية حتى يتم التعليق على جميع الشرائح. خيار بديل لسبب الأنسجة هو إرسالها إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل للتحليل الجزيئي.

على الشرائح باستخدام علامة لونية مختلفة لتمييز هذه البقع عن تلك التي هي TMA. بعد إجراء جميع التعليقات التوضيحية ، احفظ ملف جدول بيانات يحتوي على قائمة بجميع الشرائح مع التعليقات التوضيحية المقابلة لها وألوان التعليقات التوضيحية. ابدأ إعادة بناء الأنسجة الدقيقة عن طريق استرداد كتل أنسجة البارافين المقابلة لجميع الشرائح الرقمية المشروحة ، من الآن فصاعدا.

تسمى كتل المتبرعين. قم بفرز الكتل بنفس ترتيب الشرائح الرقمية. تأكد من أن كل كتلة لا يقل سمكها عن أربعة ملليمترات.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستحتاج الأنسجة إلى إعادة اختراعها على الكمبيوتر. افتح المصفوفة الدقيقة للأنسجة للبرنامج وقدم اسما للمشروع. انتقل إلى تغيير الأداة وحدد قطر الأداة المطلوب.

الآن قم بتحميل ما يصل إلى 12 كتلة مستلمة في الجهاز. لاحظ أسماء الكتل. يجب تسميتها جميعا باستخدام نفس نظام الترقيم من أجل الاتساق.

ثم في البرنامج ، قم بتعيين الاسم المناسب لكل كتلة لإنشاء تخطيط TMA. أولا ، قم بعمل تصميم TMA جديد عن طريق تعيين عدد الصفوف والأعمدة والخطوط الفارغة وتباعد اللكمات. احفظ التخطيط وقم بتعيينه إلى الكتلة.

ثم كرر العملية للكتلة التالية. باستخدام تخطيط جديد أو نفس التخطيط، يمكن تغيير الأحجام الأساسية بين كتل المستلمين. بعد ذلك ، قم بتحميل ما يصل إلى 60 كتلة مانحة في الجهاز.

ما يصل إلى 10 كتل تناسب كل صف. A من خلال F.سيتم تحميل كتل المتبرعين المتبقية لاحقا في البرنامج. امنح كل كتلة مانحة اسما تعريفيا.

سيتم الحصول على صورة لكل كتلة تلقائيا. الآن قم بمحاذاة الشرائح الرقمية مع كتل المانحين المقابلة لها. أولا، حدد مكونة.

ثم انقر فوق الشريحة وقارن بين الشريحة وحظر الصور جنبا إلى جنب. حدد النقاط المرجعية على صورة كتلة المتبرع التي تتوافق مع نقاط محددة على الشريحة الرقمية المقابلة. ثم انقر فوق التالي وستنتقل التعليقات التوضيحية إلى صورة كتلة المتبرع.

إذا كانت التعليقات التوضيحية صحيحة، فانقر فوق كل منها لتأكيد موقعها. ثم انقر فوق ابدأ. يطالب هذا المصفوفة الدقيقة بحفر ثقب في النقطة المرجعية في كتلة المستلم ، ثم عمل ثقب من الكتلة المانحة في نفس الموقع ونقل النواة إلى الكتلة المستلمة.

لتجميع النوى إلى أنبوب PCR ، انقر فوق أداة PCR للكتلة. يمكن استخدام ما يصل إلى أربعة تعليقات توضيحية لتزويد الأنبوب. بمجرد ضبطها ، انقر فوق ابدأ وسيتم استدعاء المتبرع وتحميل الأنبوب.

بعد أن تقوم الآلة بالثقب واللكمات ، قم بتحديث صورة كتلة المانح. تابع تكرار المحاذاة والتعليق التوضيحي للكتلة التالية. ثم الأساسية.

استمر في القيام بذلك لكل كتلة مانحة. سيكون ذلك في TMA. عند اكتمال المجموعة الأولى المكونة من 60 كتلة مانحة ، قم بتفريغها وتحميلها في 60 كتلة أخرى.

استمر في العملية حتى يتم ترتيب جميع الكتل المانحة. بعد أخذ حوالي 500 نواة ، قم بتنظيف المثقاب وسوف تتحول أداة التثقيب. عند اكتمال المصفوفات، قم بتصدير المشروع.

سيكون ملف جدول البيانات الذي يحتوي على بيانات المشروع في مجلد التصدير. يعرض موقع كل عينة داخل كل كتلة TMA. ثم احفظ صور كتلة المتبرع مع التعليقات التوضيحية المتراكبة كملفات JPEG في مجلد التصدير.

هذا يكمل عملية إنشاء كتلة TMA. يعرض تخطيط TMA هذا ست كتل NG TMA تم إنشاؤها في نسختين ل 12 كتلة نهائية لملء المصفوفة. احتوت كل كتلة ورمية على 402 بقعة نسيجية واحتوت كل كتلة نسيجية طبيعية على 268 بقعة.

بعد التعليق على 60 كتلة مانحة ، تم تثقيب السبب. كان وقت النقل الأساسي حوالي 12 ثانية. كانت الخسارة الأساسية ضئيلة ، وكان الوقت الإجمالي للمصفوفة ، وكان هذا المشروع حوالي 24 ساعة.

وشمل ذلك الوقت المستغرق لاكتشاف سبب التحليل الجزيئي اللاحق بعد عملية N-G-T-M-A. يمكن تطبيق طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية في تهجين cyto وحتى البقع الخاصة على هذه المصفوفات الدقيقة للأنسجة من أجل الإجابة على بعض الأسئلة مثل الجينات أو البروتينات التي يتم التعبير عنها أو حتى تغييرها في الأنسجة المختلفة.