ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير فحص النمط الظاهري الذي توسط فيه IES botulinum انقسام الركيزة SNAP 25 بهدف تحديد الجزيئات الصغيرة التي تمنع وظيفة السموم أثناء الإشارات العصبية الطبيعية. يتسبب جهد الفعل في ربط SNAP 25 الحويصلة المشبكية بغشاء البلازما لطرف الخلايا العصبية الحركية مما يؤدي إلى إطلاق ناقل عصبي. ومع ذلك ، عند وجود السموم العصبية للبوتولينوم ، يتم امتصاصه عن طريق الالتقام الخلوي ويتم إطلاقه في البوتون المشبكي حيث يشق SNAP 25 وبالتالي يتداخل مع إطلاق الناقل العصبي الذي يسبب الشلل.

يحدد هذا الاختبار الجزيئات التي يمكن أن تمنع نشاط توكسين البوتولينوم وبالتالي تمنع انقسام SNAP 25 في وجود توكسين البوتولينوم وبالتالي استعادة إطلاق الناقل العصبي في الوصلة العصبية العضلية. يتم استخدام مقايسة تصوير عالية المحتوى يتم إجراؤها باستخدام الخلايا العصبية الحركية للفأر لإثبات الحفاظ على SNAP 25 مما يؤدي إلى تحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تمنع نشاط البروتياز المعدني للسموم العصبية للبوتولينوم. الميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا أو الأساليب الحالية مثل الفحص الكيميائي الحيوي الخالي من الخلايا ، هي أنه يمكن التقاط نقاط نهاية متعددة من النمط الظاهري في وقت واحد من بئر واحد يحتوي على خلايا عصبية حركية معالجة بمركبات الفحص والسموم.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية التي تواجهها أثناء فحص المكتبة ، مثل القياس الكمي للنشاط الخلوي والسمية الخلوية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج تسمم البوتولينوم لأنها يمكن أن تحدد المثبطات التي تعمل إما بشكل مباشر عن طريق منع نشاط البروتياز المعدني أو بشكل غير مباشر من خلال منع معالجة امتصاص السموم ، أو ربما آليات أخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحسين ظروف التلوين المناعي اللازمة للكشف عن SNAP 25 قد يكون أمرا صعبا.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب إتقان خطوة التلوين المناعي لأن المحرك من حولهم حساس إلى حد ما. خطوات الوقوف والغسيل هي المفتاح لتطوير صور عالية الجودة مطلوبة للتحليل النهائي. يتم إجراء جميع الدراسات التي تستخدم الخلايا الحية والسموم النشطة في ظل ظروف السلامة البيولوجية من المستوى الثاني ، وتطهير مناطق العمل قبل وبعد هذه التجارب باستخدام منظف مطهر بنسبة 5٪ ، مثل محلول الكيمياء الدقيقة.

بعد تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية كما هو موضح في بروتوكول النص ، استخدم ماصة يدوية ذات 12 قناة لتحل محل الوسائط القديمة. في 96 لوحة بئر تحتوي على 80 ميكرولترا من وسائط التمايز الطرفية الطازجة ، تقوم بتنفيذ خطوات الشفط والتوزيع صفا تلو الآخر لتقليل تعرض الخلايا للهواء المحيط. بعد ذلك، باستخدام ماصة 12 قناة، أضف 10 ميكرولترات من 10 × من مركبات الاختبار من لوحة المصدر، ثم استنشق مرتين لخلط x.

عالج عمودين من ستة آبار مع 10 X-D-M-S-O مخفف في الوسائط لتكون بمثابة عناصر تحكم عالية في الإشارة وإشارة منخفضة. احتضان الخلايا بالمركبات لمدة 30 دقيقة عند سبع درجات مئوية و 6٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بتخفيف السم العصبي للبوتولينوم A في PBS باستخدام وسائط التمايز الطرفية للحصول على مخزون عمل نهائي 10 × باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وأضف 10 ميكرولترات من 10 × السم العصبي البوتولينوم مخزونا إلى الآبار المخصصة للمعالجة وأيضا إلى آبار التحكم في الإشارة المنخفضة.

عالج الآبار المعينة على أنها تحكم عال بالوسائط وحدها ، وقم بتطهير جميع التآكل البلاستيكي والمستهلكات الأخرى التي تتلامس مع السموم العصبية للبوتولينوم. أ عن طريق الغمر في محلول هيبوكلوريت 0.825٪ في الماء لمدة 20 دقيقة على الأقل. قم بتسمية الألواح بوضوح للدلالة على استخدام السموم واحتضان الألواح لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 6٪ ثاني أكسيد الكربون بعد الحضانة.

استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الوسائط التي تحتوي على السم والمركبات من كل بئر والتخلص منها في محلول مبيض بنسبة 10٪. ثم أضف 100 ميكرولتر من الميثانول المثلج مباشرة إلى كل بئر لإيقاف السم العصبي للبوتولينوم. انقسام محلل للبروتين.

بعد ذلك ، احتضن الألواح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بحدوث التثبيت. بعد التثبيت ، تعامل مع الكواشف المعادلة المهملة ببروتوكولات السلامة البيولوجية من المستوى الأول وتخلص منها وفقا لذلك. بعد التخلص من الميثانول ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من PBS لإعادة ترطيبها قبل تلطيخ المناعة.

يتم إجراء التلوين المناعي الذي يتم إجراؤه في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية باستخدام محطة عمل آلية مرتبة لتمكين الوصول إلى الكاشف حسب الحاجة ودون تدخل بشري. قم بتحميل الألواح التي تحتوي على الخلايا الثابتة في مجلة PLATE وانقلها إلى سطح السفينة حسب الحاجة لعمليات مناولة السوائل. باستخدام رأس الماصة 96 المزود بأطراف سعة 250 ميكرولتر ، تقوم محطة العمل بشفط PBS من الآبار إلى 10 ميكرولتر.

توزع محطة العمل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 1٪ مصل حصان و 0.1٪ من 20 في PBS في جميع الألواح الدقيقة. ثم أعد اللوحات إلى مجلة اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع وقم بتوزيع 50 ميكرولتر من أربعة ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد BS و 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر من بيتا ثلاثة توبولين في حجب المخزن المؤقت في جميع الألواح.

احتضن الألواح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسلها ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من PBST. قم بإعداد ميكروغرامين لكل مليلتر ، وتخفيفات الأجسام المضادة الثانوية المصنفة بأربعة فلورو مختلفة كما هو موضح في بروتوكول النص. ضعي 50 ميكرولترا من الخليط في كل بئر واحتضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، استنشق الأجسام المضادة الثانوية واغسلها ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من PBST.

بعد ذلك ، عند 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 32 خطافا ميكرومولار صبغة لتلطيخ الحمض النووي للكشف عن النوى. أخيرا ، أغلق الألواح بغشاء خفيف غير منفذ لحماية الفلورو من التبييض الضوئي. يمكن تخزين اللوحات عند أربع درجات مئوية لأسابيع دون فقدان كبير للإشارة.

في نظام الحصول على الصور ، حدد نوع اللوحة ك مطحنة u. امسح التخطيط ك 96. حسنا ، قم بتنسيق عدد الحقول على أنه 16 والهدف على أنه 20 × ماء.

ثم حدد قنوات إثارة النواة بمقدار 405 نانومتر. حدد القناة الرابعة لإثارة السيتوبلازم بحجم 640 نانومتر. حدد القناة الثانية لإثارة قناة الجسم المضاد الخاص بالمستضد بمقدار 561 نانومتر حدد القناة الثالثة.

بعد ذلك ، قم بإعداد قوة الإثارة لكل ليزر. ستحتوي التجربة على تعريضين لضبط التعرض ، واحد إلى واحد عند 640 نانومتر وضبط التعرض من اثنين إلى اثنين من الإثارة عند 405 نانومتر و 561 نانومتر. حدد Benning كحاوية اثنين.

استخدم آبار التحكم العالية لتحسين التعريض الضوئي بأقصى كثافة كقناة SNAP 25 واستخدم آبار التحكم المنخفضة لأقل كثافة. اضبط التعريض الضوئي بحيث تكون شدة كل قناة حوالي نصف مستوى التشبع أو حوالي 2000 إلى 2,500 وحدة نسبية. بعد ذلك ، حدد مستوى Z الأمثل على قناة قناع الخلية باستخدام البرنامج النصي لتصحيح دلتا.

في برنامج تحليل الصور ، حدد خوارزمية neurite لتقسيم الأعصاب. تحديد مناطق العصبية بناء على الكائنات الثانوية ، العصبيات ، باستخدام تمدد ناقص ثلاثة بكسل لقناة بيتا ثلاثة توبولين كقناع. احسب شدة قنوات الإشارة لمنطقة العصبية وقناة بيتا ثلاثة توبولين.

حدد المعلمات المطلوبة للتصدير مثل طول النيوريت ، ومتوسط شدة SNAP 25 بيتا ثلاثة ، وعدد نوى التوبولين ورقم مقطع العصب. مع اكتمال الإعداد. انقل اللوحات من مكدسات الألواح باستخدام الروبوت ، وقم بتحميلها في جهاز التصوير عالي المحتوى وابدأ في الحصول على الصور.

يظهر هنا تحليل مخطط الصندوق للنسبة المئوية للانقسام المحسوب من آبار التحكم. يمثل اللون الوردي التحكم العالي في الإشارة وهو الآبار التي تحتوي على وسائط فقط وبدون سام. لوحظ انقسام ضئيل جدا في هذه الآبار.

يمثل اللون الأزرق التحكم في الإشارة المنخفضة ، وهو الآبار التي تحتوي على سم فقط ولا يوجد مركب عينة. سجلت هذه الآبار انقساما كبيرا. توضح توزيعات الرسم البياني لقيم التحكم المسافة بين مجموعتي التحكم.

الهدف من عملية الفحص هو العثور على مركبات داخل مجموعة العينة بقيم أقرب إلى مجموعة التحكم الإيجابية. يظهر توزيع 192 عينة معالجة مركب ، والتي تحتوي أيضا على السم العصبي البوتولينوم أ هنا باللون الأخضر. أظهرت معظم هذه الآبار انقساما كبيرا.

ومع ذلك ، كان هناك عدد قليل من القيم المتطرفة ذات الدلالة الإحصائية التي لم تظهر انقساما كبيرا عند مقارنتها بالضوابط. يتم عرض قيم التحكم مرة أخرى بواسطة الأشرطة الوردية والزرقاء في توزيع الرسم البياني هذا. أظهرت الأشرطة الخضراء تداخل قيم العينة مع قيم التحكم.

تم اختيار قيم العينة التي تم اعتبارها نتائج من القيم المتطرفة التي تحتوي على قيم انقسام مئوية أقل من ثلاثة انحرافات معيارية عن متوسط مجتمع العينة. هذه الضربات الأربع لها قيم مماثلة للتحكم العالي في الإشارة وتمثل نفس المركب ، وهو سم عصبي معروف للبوتولينوم ، وهو مثبط للمشابك العصبية الذي يمنع انقسام SNAP 25. أظهر هذا المثبط حماية قوية من SNAP 25 ضد السموم العصبية البوتولينوم أ وكذلك مع كل من السم وهذا المثبط يتصرف بشكل مشابه للآبار التي لا تحتوي على سم وبشكل غير مشابه للآبار التي تحتوي على السم ، ولكن بدون المثبط بمجرد إتقانه.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تضمين عناصر تحكم متعددة من أجل حساب الأداء الإحصائي للمقال وتمكين قرار فشل النجاح لكل لوحة فحص فردية باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الحالة للبروتين الكيميائية الحيوية للإجابة على أسئلة إضافية مثل تقييم نتائج الفحص كمثبطات مباشرة أو غير مباشرة ل Bot.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية أتمتة فحص النمط الظاهري الذي يستخدم القياس الكمي ل SNAP 25 عبر التلوين المناعي كنقطة نهاية أساسية. لا تنس أن العمل مع السموم العصبية للبوتولينوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية والاحتياطات مثل استخدام معدات الحماية الشخصية وتنفيذ إجراءات إزالة التلوث والتخلص المناسبة من البوتين. يجب دائما تناول السموم العصبية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.