دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

الهدف من هذا الإجراء هو اكتشاف الوفرة النسبية لبروتينات معينة وتحديدها بدقة داخل عينة بيولوجية معقدة باستخدام الالتواء الكمي والفلوري والنشاف. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول مستخلصات بروتين منفصلة بالفلورية الكهربائية باستخدام هلام متدرج مسبقة الصب. في الخطوة الثانية ، يتم التحقق من حمل البروتين المكافئ عبر جميع ممرات العينة من خلال تطبيق صبغة بروتين كاملة ، ثم يتم استخدام نظام النقل السريع شبه الجاف لكتلة العين لنقل العينات إلى غشاء A-P-V-D-F.

أخيرا ، يتم فحص البروتينات بأجسام مضادة أولية محددة متبوعة بالجسم المضاد الثانوي المناسب الموسوم بالفلورسنت لتسهيل اكتشافها الحساس والقوي والخطي عند الأطوال الموجية للأشعة تحت الحمراء والأحمر البعيد. في النهاية ، يمكن استخدام الإزهار الغربي الفلوري الكمي لاكتشاف عدد كبير من البروتينات المرتبطة بالغشاء والقابلة للذوبان وتصوره وتحديده بدقة عبر مجموعة واسعة من عينات الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التصوير القائم على ECL ، هي أنها تسمح بحساسية أكبر مع دقة معززة على نطاق خطي واسع لقراءة كمية حقيقية ابدأ بنقع عينة الأنسجة يدويا ، متبوعا بالتجانس في مخزن الاستخراج المعد حديثا بحوالي وزن من واحد إلى 10 أنسجة لكل حجم عازل حتى يتم إنتاج تجانس متسق سلس.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلية المحللة لمدة 20 دقيقة عند 20،000 مرة G عند أربع درجات مئوية. ثم انقل الطبقة التي تحتوي على البروتينات القابلة للذوبان إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف وقم بتخزين كل من الحبيبات والكسور الطافية S عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة. بعد تحديد تركيز البروتين في supinate ، قم بنقل 15 ميكروغراما من البروتين لكل عينة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة.

ثم قم بإحضار الحجم النهائي لكل عينة حتى 10 ميكرولتر بالماء المقطر وأضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحميل الفوركس. قم بتحريك المحاليل الخلوية جيدا عن طريق الدوامة ، ثم قم بتسخين العينات عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتشويه طبيعة البروتينات. بعد التمسخ ، أضف ثلاثة ميكرولترات من معيار الوزن الجزيئي المناسب في البئر الأول من كل من المواد الهلامية التجريبية والتحكم في التحميل.

بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في الآبار اللاحقة المناسبة بعد الرحلان الكهربائي. استخدم سكين جل لتحرير المواد الهلامية من الكاسيت وإزالة الآبار وقدم الجل. ضع علامة على الجل للمساعدة في التوجيه اللاحق.

ثم لتحديد حمل البروتين المكافئ ، قم بصب ما يقرب من 30 ملليلتر من صبغة البروتين في طبق بتري مربع 12 × 12 سم ووضع هلام التحكم في التحميل في البقعة ، مما يضمن أن المحلول يغطي الجل بأكمله. حرك الجل برفق لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلص من بقعة البروتين واغسل الجل ثلاث مرات في الماء المقطر قبل تصور كتلة العين. اثنان من نقل البروتين السريع شبه الجاف بعد الرحلان الكهربائي ، قم بإعداد كومة النقل السفلية عن طريق إزالة غطاء الرقائق وترطيب الغشاء مسبقا باستخدام عازلة قيد التشغيل مباشرة من خزان الجل.

أعد تبليل ورق الترشيح بالماء المقطر في هذا الوقت أيضا. بعد ذلك ، قم بربط الجل التجريبي على كومة النقل السفلية المعدة ، ثم ضع ورق الترشيح قبل العمل فوق الجل ولفهما لضمان عدم احتجاز الفقاعات بين الطبقات. ضع المكدس العلوي أعلى ورق الترشيح والمكدس السفلي.

ثم قم بلف شطيرة كومة النقل للتخلص من أي فقاعات هواء. أدخل الإسفنجة من مجموعة كومة النقل على الوسادة الماصة وضع شطيرة كومة النقل في المساحة المخصصة. ثم أغلق الغطاء بإحكام وابدأ تشغيل I block two ، وانقل البروتينات لمدة سبع دقائق في البرنامج الثالث.

عند انتهاء البرنامج ، قم بإزالة كومة النقل من آلة كتلة العين وقم بتقشير كومة النقل العلوية وطبقات ورق الترشيح التي تعرض الجل على مكدس النقل السفلي. استخدم مشرطا لقطع الجل مع الحرص على عمل قطع مثلث لأغراض التوجيه على الغشاء بعد تقليم الغشاء للتحقق من بقعة البروتين بكفاءة النقل ، الجل كما هو موضح للتو ، ثم نقل الغشاء بسرعة إلى أنبوب نظيف سعة 50 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS لأول ثلاثة ، خمس دقائق يغسل على أسطوانة ميكانيكية. بعد الغسيل الثالث ، تخلص من مخزن الغسيل واحتضان الغشاء في مخزن مانع غير مخفف لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، احتضان الغشاء في الجسم المضاد الأولي المخفف في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المانع و 0.1 بين 20 بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع تحريض مستمر. في صباح اليوم التالي بعد التخلص من محلول الأجسام المضادة الأولية ، اغسل الغشاء ست مرات لمدة خمس دقائق في PBS كما هو موضح للتو. ثم احتضان الغشاء في الظلام بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة الفلورسنت ، متوسعة في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المانع و 0.1٪ بين 20 مع تحريض مستمر ، متبوعا بست غسلات PBS لمدة خمس دقائق لجميع التصوير.

أولا ، قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر وجهاز التصوير. ثم افتح برنامج التصوير لتصوير اللطخة الغربية. أولا ، افتح غطاء جهاز التصوير واسكب كمية صغيرة من PBS على الزجاج.

في الزاوية اليسرى السفلية من جهاز التصوير ، ضع الغشاء أعلى PBS مع التأكد من أنه مربع مع المحور الموجود على جهاز التصوير ، وترك فجوة سنتيمتر واحد بين الغشاء ومحور الشبكة. قم بلف الغشاء للتأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة بين الزجاج والغشاء ، ثم احسب عدد المربعات التي يشغلها الغشاء على المحور x و y. بعد ذلك ، أغلق غطاء جهاز التصوير وأدخل عدد المربعات في برنامج الكمبيوتر.

حدد قناة الأشعة تحت الحمراء المناسبة والشدة المناسبة ، وابدأ الفحص لتصور بقعة البروتين الكلية لجل التحكم في التحميل. قم بإصلاح الجل وجهاز التصوير كما هو موضح للتو للغشاء التجريبي ، ثم حدد القناة 700. اضبط الكثافة على خمسة وابدأ الفحص.

لتحديد بيانات المسح. ابدأ بضبط أزرار السطوع والتباين للملف الممسوح ضوئيا لإنتاج أفضل جودة للصورة ، وتدوير الصور اللازمة لتحقيق الاتجاه المطلوب. بعد ذلك ، حدد مستطيلا من قائمة الأشكال واستخدمه لرسم مستطيل حول الممر بأكمله.

في حارة العينة الأولى. انسخ الشكل والصقه حول الممر الأول لتذوق الممر الثاني. بعد التأكد من أن قياس الخلفية لا يتضمن إشارة في المسار التالي ، ارسم مستطيلا حول كل حارة لبقية ممرات العينة.

ثم اعرض إشارة جدول الأشكال لكل مستطيل مرسوم بوحدات فلورية عشوائية واحفظ الصورة كصفراء صلبة. هناك عدد من تدابير التحكم التي تعتبر ضرورية لضمان جمع البيانات الدقيقة أثناء النشاف الغربي الفلوري الكمي. على سبيل المثال ، من المستحسن تضمين عينات التحكم الإيجابية.

ثانيا ، من المهم تحسين وقت النقل لضمان حركة مكافئة للبروتينات ذات الوزن الجزيئي المرتفع والمنخفض من الجل إلى الغشاء. ثالثا ، يجب تحديد تخفيفات الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة لتجنب التفسير غير الصحيح للبروتينات ذات الأهمية بسبب النطاقات غير المحددة كما هو موضح في هذه الصور. رابعا ، من المهم النظر فيما إذا كان من الضروري وجود جسم مضاد ثانوي يتم تربيته في نوع مضيف مختلف ، خاصة في الحالات التي لا يتم فيها اكتشاف نطاق البروتين المتوقع.

خامسا ، يمكن أن يؤكد إنتاج هلام التحكم في التحميل توحيد حمل العينة. عند دمجه مع تحليل البروتين الكلي ، يمكن بعد ذلك استخدام الجل لمقارنة وقياس حمل البروتين في كل حارة في نطاقات الوزن الجزيئي المختلفة كما تم قياسها مقابل كل عينة. أخيرا ، تفسح هذه التقنية المجال لتجريد الأغشية وإعادة فحصها بمرونة أكبر من تلألؤ كيمي بسبب عوامل تشمل على سبيل المثال لا الحصر ، زيادة الحساسية ، وانخفاض الخلفية ، واكتشاف اللون المزدوج ، واستقرار الغشاء في ظل ظروف التخزين طويلة الأجل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام المخطط الغربي الفلوري الكمي لاكتشاف البروتينات ذات الأهمية وتحديدها بدقة ، بالإضافة إلى كيفية استكشاف المشكلات الشائعة التي يمكن أن تحدث عند تنفيذ هذه التقنية وإصلاحها.