ل في المختبر الأنزيمية الفحص لقياس النسخ تثبيط من قبل الغاليوم (III) وH 3 5،10،15-تريس (pentafluorophenyl) corroles

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ما إذا كانت المركبات المحتملة المضادة للسرطان تمنع الحمض النووي الضلعي أو نسخ الحمض النووي الريبي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد تفاعلات نسخ الحمض النووي الريبي أولا ، بما في ذلك المثبطات المحتملة في هذه التجربة ، يتم فحص مركبات CHO التي تظهر خصائص سامة للخلايا التفاضلية لتثبيط نسخ الحمض النووي الريبي ومقارنتها بالمثبطات المعروفة. بعد خلط التفاعلات جيدا ، يتم تحضين أنابيب التفاعل عند 37 درجة مئوية وتتم إزالة الحصص في النقاط الزمنية المطلوبة.

يستخدم الرحلان الكهربائي للهلام التالي لتقييم التثبيط النسبي لأن بروميد الإيريديوم يتألق عند ارتباط الحمض النووي الريبي ، تتوافق النطاقات الداكنة في الجل مع تركيزات أعلى من الحمض النووي الريبي. لتحديد مدى تثبيط النسخ ، يتم إجراء الأشعة فوق البنفسجية أو المرئية أو الأشعة فوق البنفسجية مقابل التحليل الطيفي. في النهاية ، يوضح هذا الفيديو طريقة مباشرة لتقييم خصائص المرشحين المضادة للسرطان.

من خلال تقييم تثبيط النسخ بواسطة الشعاب المرجانية ، يجب تقييم الأدوية المحتملة المضادة للسرطان لقدرتها على تثبيط الحمض النووي الريبي. نسخ. غالبا ما تعتمد الخلايا السرطانية البشرية على جين ورمي واحد منشط لعلاجات البقاء على قيد الحياة. منع التعبير عن الجينات المسرطنة فعال في القضاء على الخلايا السرطانية.

يعد إجراء تثبيط نسخ الحمض النووي الريبي الموصوف هنا طريقة مفيدة لتحديد الأدوية المرشحة المحتملة المضادة للسرطان ومعرفة المزيد عن آلية عملها. للبدء في إعداد مركبات كارول والمثبطات في نسبة 0.01 إلى واحد مولر من المركب إلى الحمض النووي. للقيام بذلك ، قم بإذابة cin d طرابلس و TPFC و Galium TPFC وأكسيد ثنائي ميثيل كبريتات في حاويات منفصلة نظيفة.

احصل على التركيز النهائي باستخدام تخفيف الحبوب بالماء الخالي من النوكلياز قبل بدء تفاعل النسخ. قم بإعداد الكواشف اللازمة بشكل فردي أو شرائها من بائع تجاري. قم بإذابة جميع الكواشف المجمدة على الجليد.

ثم اجمع الكواشف لتفاعل النسخ في درجة حرارة الغرفة كما هو موضح في بروتوكول النص. امزج جيدا عن طريق تحريك الأنبوب أو سحب الخليط لأعلى ولأسفل برفق قبل احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة أربعة أجزاء ميكرولتر من كل تفاعل بعد كل ساعة وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر ، مع تعديلها حسب الحاجة للنقاط الزمنية المطلوبة بعد تفاعل النسخ.

قم بتنقية الحمض النووي الريبي من مكونات التفاعل الأخرى باستخدام أعمدة دوران الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح في بروتوكول النص لإجراء الرحلان الكهربائي للهلام agros ، وإعداد خلات ثلاثية ، أو EDTA أو TAE ، ومحلول مخزون 1000 × من بروميد الإثيريوم. وكما هو موضح في بروتوكول النص ، ارتد دائما معدات الحماية المناسبة عند العمل مع بروميد الإثيريوم لأنه سام. بعد ذلك ، قم بإعداد جل 1٪ aros عن طريق إذابة 10 جرامات من agros فائقة النقاء في لتر واحد من مخزن XTAE المخزن المؤقت وإذابة agros بفرن ميكروويف تقليدي.

بمجرد أن يبرد إلى 50 درجة مئوية ، أضف ملليلتر واحدا من 1000 × بروميد الإيريديوم إلى محلول هلام agros 1٪ واخلطه عن طريق التحريك برفق أو عن طريق التقليب في وعاء مغلق. ثم صب المحلول الزراعي في منصة صب الهلام واترك الجل يتجمد في درجة حرارة الغرفة بعد أن يصلب الجل. قم بإزالة الأوتاد من خزان الرحلان الكهربائي وأضف ما يكفي من المخزن المؤقت TAE لتغطية الجل حتى يتم غمر الآبار.

تأكد من أن مستوى المخزن المؤقت TAE أعلى بحوالي ملليمتر واحد من مستوى الجل قبل إزالة مشط الجل. لتحضير عينات الحمض النووي الريبي للرحلان الكهربائي للهلام، اجمع ميكرولتر واحد من كل عينة منقاة مع ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت لتحميل الجل الممزوج جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة دقيقة لتحميل الجل مع كل عينة عن طريق سحب المحلول بعناية في قاع كل عينة. حسنا ، احرص على عدم ترك أي فقاعات هواء أو خلط العينات بين الآبار.

قم بإرفاق الخيوط بحيث ينتقل الحمض النووي إلى الجل باتجاه الرصاص الموجب. اضبط الجهد على المستوى المطلوب. عادة من واحد إلى 10 فولت لكل سنتيمتر من الجل.

سيعمل هلام 23 سم × 25 سم عند 250 فولت لمدة ساعة واحدة تقريبا. سيعمل هلام بحجم ثمانية سنتيمترات × ثمانية سنتيمترات عند 150 فولت لمدة 20 دقيقة تقريبا. تعمل شظايا الحمض النووي الريبي الأصغر بدقة أفضل عند الفولتية الأعلى.

قم بتشغيل الجل مهما كانت المدة كافية للفصل الكبير بين شظايا الحمض النووي الريبي المحتملة باستخدام هجرة الأصباغ لمراقبة تقدم الفصل. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة قبل ترحيل الصبغة من مخزن التحميل المؤقت إلى نهاية صورة الجل. سوف يتألق الحمض النووي الريبي تحت الأشعة فوق البنفسجية مثل بروميد الأثيريوم ، ويلتقط صورة للصورة ويقارن شدة الفلورسنت للحمض النووي الريبي المنقى من كل حالة.

لإجراء القياس الكمي للحمض النووي الريبي باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ، ضع ميكرولترين من الماء على جهاز NanoDrop 2000 أو جهاز مشابه وقم بقياس الفراغ. بعد ذلك ، ضع ميكرولترين من كل عينة من الحمض النووي الريبي بعد التنقية على مقياس الطيف الضوئي وقم بقياس الضوء المرئي فوق البنفسجي من نطاق الطول الموجي من 200 نانومتر إلى 800 نانومتر في حالة أن الامتصاص أعلى من كثافة بصرية واحدة. خفف العينات في الماء الخالي من النوكلياز للحصول على كثافة بصرية أقل من واحد.

أخيرا ، استخدم برنامج الرسوم البيانية لرسم العينات المختلفة ومقارنة الكثافة الضوئية عند 260 نانومتر ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام لتصوير الحمض النووي الريبي المنسوخ. إذا كان المركب يمنع نسخ الحمض النووي الريبي ، تقليل إنتاج الحمض النووي الريبي وسيظهر الحظر أخف وزنا. يظهر الأكتين د والتربتولين انخفاضا واضحا في الحمض النووي الريبي عند مقارنته بالتحكم كما هو متوقع من هذه المثبطات المدروسة منذ فترة طويلة.

يحتوي نطاق Gallium TPFC أيضا على مستوى منخفض جدا من الحمض النووي الريبي بينما يظهر نطاق TPFC القليل من التثبيط أو لا يظهر نفس الكثافة النسبية مثل الأشعة فوق البنفسجية للتحكم مقابل القياسات التي تم أخذها لكل عينة. بعد الخضوع لنسخ الحمض النووي الريبي لمدة أربع ساعات وتنقيته باستخدام كروماتوغرافيا عمود دوران الحمض النووي الريبي ، تظهر هنا أطياف الأطوال الموجية من 220 نانومتر إلى 350 نانومتر.

أسفرت ثلاثة من تفاعلات النسخ الأربعة المعالجة بالمثبطات عن حمض النووي الريبي الأصغر من التحكم مع الحمض النووي المعالج بالغاليوم TPFC الذي ينسخ واحدا فقط من 14 من الحمض النووي الريبي المعالج مثل الحمض النووي المعالج D-N-A-T-P-F-C لم يظهر أي تثبيط واضح. وبالتالي ، فإن السمية الخلوية في خطوط الخلايا المعالجة ب TPFC لا ترجع إلى تثبيط نسخ الحمض النووي الريبي. جميع العينات لديها امتصاص 260 على نسبة 280 نانومتر تبلغ حوالي 2.2 مما يشير إلى عينات نقية نسبيا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن اختبار متغيرات أخرى في التفاعل مثل التركيز وترتيب الجمع من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل آلية العمل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ما إذا كان مركب المضاد للسرطان يثبط نسخ الحمض النووي الريبي. لا تنس أن البروميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية على صحتك.

ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ولا تستخدم أبدا محاليل الميكروويف أو الأغرويات التي تحتوي على بروميد الأثين.