إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس وظيفة مجموعة من قنوات CFTR في نظام مُعاد تكوينه، وفحص استجابة هذه القنوات لوجود جزيئات مُعدِّلة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنقية بروتين CFTR من النوع البري أو الطافر من خلايا SF nine باستخدام إجراء تنقية سريع، مما ينتج عنه بروتين CFTR وظيفي في محلول منظف. وتتمثل الخطوة الثانية في إعادة تكوين البروتين المنقى داخل ليبوزومات بروتينية من دهون محددة يختارها الباحث.

بعد ذلك، يتم إنشاء تدرج كيميائي لليوديد عبر الغشاء عن طريق إزالة اليوديد الفائض من الليبوزومات لتوليد قوة دافعة لحركة الأيونات عبر قناة CFTR. وتتمثل الخطوة النهائية في تنشيط القناة وبدء تحرر اليوديد من ليبوزومات البروتيا في وجود جزيء المعدِّل المراد دراسته. وفي النهاية، يُستخدم قطب كهربائي انتقائي لليوديد لمراقبة وظيفة قناة CFTR في الوقت الفعلي في هذا النظام المعاد تشكيله.

تتيح هذه الطريقة دراسة نشاط قناة الكلور لمجموعة منقاة من جزيئات CFTR بعد إعادة بنائها في ليبوسومات الفوسفوليبيد. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة صُممت لتقديم رؤى حول وظيفة قناة C-F-D-R-N nine وتأثير المعدِّلات الجزيئية الصغيرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل التوصيف الوظيفي لبروتينات غشائية أخرى. ولتحقيق النجاح، يجب على الأشخاص الجدد في استخدام هذه الطريقة التأكد من تحسين نسب البروتين إلى الليبيد الخاصة بنظامهم، والتأكد من أنهم لا يعملون ببروتين ضعيف الوظيفة أو غير فعال، ومن أنهم قد ولّدوا تدرجاً كافياً من اليوديد عبر حويصلات محكمة الإغلاق.

لتحضير الليبيد، قم أولاً بتجفيف 5 mg من فوسفاتيديل كولين البيض (egg PC) في أنبوب زجاجي غير بوروسيليكاتي تحت تدفق من غاز الأرجون لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، احسب حجم المحلول المنظم 6 (buffer six) المطلوب كما هو موضح في البروتوكول النصي، ثم أضف المحلول المنظم 6 مباشرة إلى الليبيد. أغلق الأنبوب الزجاجي باستخدام مادة perfil ثم قم برج الأنبوب باستخدام جهاز vortex لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لتعليق الليبيد في المحلول المنظم.

بعد ذلك، قم بتعليق الليبيد في درجة حرارة الغرفة باستخدام إبرة قياس 25 مثبتة على حقنة سعة 1 مل حتى يختفي أي غشاء ليبيدي مرئي على جدار الأنبوب. سيكون المحلول المنظم عكراً بسبب الليبيد المعلق. قم بمعالجة الليبيد في الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة دفعة ثانية في حمام سونيكات يحتوي على الثلج، ثم ضع الأنبوب على الثلج ليرتاح لمدة دقيقة واحدة.

كرر هذه الدورة ثلاث مرات. بعد ذلك، أضف بروتين CFTR إلى الليبيد، للحصول على حجم نهائي قدره 1 milliliter. اخلط البروتين مع معلق الليبيد 10 مرات باستخدام إبرة عيار 25 gauge.

ضع العينة على الثلج لمدة 30 دقيقة، مع تدوير الأنبوب خمس مرات كل خمس دقائق للخلط أثناء تحضين العينة. اكسر لسان القاعدة لعمود دوران لربط المنظفات أحادي الاستخدام، ثم قم بطرد العمود مركزياً لمدة دقيقتين عند 2000 ×g. ولإزالة محلول التخزين المنظم، اغسل العمود بـ 5 mL من المحلول المنظم 7، ثم قم بطرد العمود مركزياً لمدة أربع دقائق عند 2000 ×g لشطف محلول الغسيل المنظم.

اغسل العمود ثلاث مرات، وانقل عينة البروتين والليبيد كاملة وبحجم 1 mL إلى الجزء العلوي من راتنج العمود، ثم حضن العمود لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بطرد العمود مركزياً في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق عند 2000 ×g. بعد ذلك، انقل عينة الليبوزوم البروتينية العكرة إلى أنبوب micro fuse نظيف وضع الأنبوب على الثلج. انقع 5 g من حبيبات cidex G 50 في 50 mL من buffer nine لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بتعبئة أربعة أعمدة فحص صغيرة بالخرز المشبع حتى تمتلئ بمقدار ثلاثة أرباعها على الأقل. قم بطرد مركزي للأعمدة لمدة أربع دقائق عند 2000 ×g لإزالة المنظم الزائد من الراتنج. يجب أن يكون هناك ما يقرب من 2.25 milliliters من الراتنج المعبأ في العمود بعد عملية الطرد المركزي.

من الضروري ترطيب الراتنج بشكل مناسب من أجل الشطف باستخدام ليبوزومات البروتيا. بعد ذلك، انقل 125 µL من عينة ليبوزومات البروتيا إلى أعلى كل عمود، ثم قم بالطرد المركزي لمدة أربع دقائق عند 2000 ×g. اجمع الـ EITs لاستخدامها في تجارب iodide FLX.

ضع قضيب تقليب مغناطيسي صغير من نوع F في إحدى عيون طبق يحتوي على 96 عينًا، ثم أضف 150 µL من VX seven 70 بتركيز 20 µM في buffer nine إلى العين. استخدم رأس ماصة لإزالة أي فقاعات. بعد ذلك، أضف 150 µL من عينة liposome البروتينية إلى العين ليصل الحجم الإجمالي إلى 300 µL.

ضع الصفيحة ذات الـ 96 بئراً على جهاز تحريك مغناطيسي بسرعة 130 دورة في الدقيقة. أدخل طرف القطب الحساس لليوديد في المحلول دون ملامسة قضيب التحريك أو قاع البئر. لتسجيل مخططات إشارة القطب، قم بتمرير الإشارة عبر مرشح تمرير منخفض بمعدل أخذ عينات قدره 2 هرتز، وسجل المخططات من العينة لمدة خمس دقائق للسماح للعينة بالوصول إلى حالة التوازن.

يجب أن ينتج عن ذلك خط أساس مستقر وشبه مسطح. بعد ذلك، أضف 3 µL من محلول مخزون بتركيز 100 mM من magnesium ATP عند pH 7. ولتنشيط قنوات CFTR، اترك العينة لتتوازن لمدة خمس دقائق أخرى للوصول إلى خط أساس جديد.

بعد ذلك، أضف 3 µL من محلول مخزون بتركيز 2 µM من الفالينوميسين (valinomycin) لإزالة التدرج الكهرومغناطيسي الناتج عن نشاط CFTR. قم بتسجيل الانخفاض في الجهد الناتج عن نشاط تدفق اليوديد بوساطة CFTR لمدة خمس دقائق على الأقل.

بعد ذلك، أضف 3 µL من محلول 10% Triton X 100 إلى العينة لتحرير اليوديد من تجويف ليبوزوم البروتيا كعنصر تحكم. يشير التحرير الملحوظ لليوديد إلى أن اليوديد المحتجز في الحويصلات لم يكن عاملاً محدداً لنشاط CFTR. بعد قياس العينة، قم بإعداد سلسلة تخفيف من يوديد البوتاسيوم بتركيزات تتراوح من الميكرومولار إلى النانومولار في المنظم تسعة.

ابدأ بالمحلول الأكثر تخفيفاً، وسجل استجابة القطب الكهربائي بالميلي فولت عند كل تركيز لليوديد لإنشاء منحنى قياسي. تم إجراء تحليل لبروتين CFTR من النوع البري لقياس اليوديد. قيست نشاط تدفق F بمول نانو في الثانية بعد إعادة التشكيل.

يتم تحفيز تدفق اليوديد بشكل ملحوظ في وجود CFTR و VX-770 مقارنة بالمجموعة الضابطة التي تفتقر إلى CFTR، وكذلك عند إضافة VX-770. عندما يتم فسفرة CFTR بواسطة بروتين كيناز المعتمد على cyclic AMP، وهي وحدة فرعية تحفيزية تُعرف باسم PKA، فإن المعالجة المسبقة بالمثبط القوي CFTR inhibitor-172 تؤدي على العكس من ذلك إلى تقليل معدل تدفق اليوديد. تم اختبار قدرة VX-770 على تعزيز تدفق اليوديد في CFTR من النوع البري (wild type) في حالات مع وبدون الفسفرة بواسطة PKA، وقد زاد VX-770 من تدفق اليوديد النسبي فقط في وجود CFTR المفسفر. تم تقييم فعالية VX-770 باستخدام متغير من CFTR يسمى Delta 508 CFTR، حيث تبين أن النظير غير النشط V-091188 لا يعزز نشاط Delta 508 CFTR المفسفر، بينما يقوم VX-770 بزيادة تدفق اليوديد النسبي. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمال كافة الخطوات بدءاً من التنقية وصولاً إلى قياسات نشاط CFTR في يوم عمل نموذجي مدته ثماني ساعات، حيث تستغرق تنقية CFTR حوالي أربع ساعات، وتستغرق عملية إعادة التكوين (reconstitution) ساعة أخرى قبل البدء في مقايسة eFlux.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى بما في ذلك مقايسة T PS وقياس القناة الواحدة في para lipid S باستخدام نفس التحضير لبروتين CFTR لمزيد من التوصيف للتفاعل مع الجزيئات الصغيرة. وباستخدام هذه الطرق، سيتمكن الباحث في التليف الكيسي من معالجة أسئلة رئيسية في مجال معدِّلات CFTR، وهي: هل يتفاعل هذا المعدِّل مباشرة مع بروتين CFTR، وما هي آلية عمل هذا المعدِّل.