التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير تفاعلات الخلايا المزروعة أو السلائف العصبية أو NPC المصنفة بالفلورسنت مع محاور الفلورسنت في الحبل الشوكي للفأر في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الحبل الشوكي وتضمينه بعناية من الفئران المزروعة بالشخصيات غير القابلة للعب في 5٪ aros وربطه بقلة غطاء. يمكن تغيير اتجاه الحبل الشوكي لعرض التألق في أي منطقة من الحبل الشوكي.

في الخطوة الثانية ، يتم وضع مستحضر الحبل الشوكي في مرحلة تصوير الفوتونين لتصوير الشخصيات غير القابلة للحياة أثناء دمجها بشكل فائق مع وسائط RPMI المؤكسجة الدافئة لمدة تصل إلى 10 ساعات. يتم استخدام مقسم شعاع ثنائي أحادي الحافة مناسب لفصل إرسالات YFP و GFP. في النهاية ، يسمح تصوير الفوتونين بتصور تفاعلات GFP التي تعبر عن NPCs مع YFP التي تعبر عن المحاور في الحبل الشوكي التالف في الوقت الفعلي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التوليد العصبي ، مثل ما هي إشارات الإشارات الجزيئية والخلوية اللازمة لإعادة تكوين الميالين NPC المزروعة للمحاور التالفة ، وما هي حركية أحداث إعادة الميالين هذه؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تصوير الفوتون بين المد والجزر ، والتي لا يمكن استخدامها إلا لتصوير الحبل الشوكي الظهري ، هي أن هذه الطريقة تسمح بتصوير الشخصيات غير القابلة للعب المزروعة التي هاجرت في عمق المنطقة البطنية من الحبل الشوكي. بعد تأكيد القتل الرحيم عن طريق قطع العمود الفقري ، بلل الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم استخدم مقصا دقيقا حادا لإزالة الشعر والجلد من الجزء الخلفي من ، مما أدى إلى تعريض العمود الفقري من الصفيحة العنقية تقريبا أو C واحد إلى الصفيحة العجزية أربعة أو S أربعة.

بعد ذلك ، باستخدام مشرط بشفرة رقم 10 ، قم بعمل شقوق على يسار ويمين العمود الفقري لفصله عن العضلات المحيطة والأنسجة الدهنية أيضا بقطع الأنسجة الزائدة حول العمود الفقري وفوقه. سيسمح ذلك بإزالة الفقرات بسهولة. ثم أثناء الإمساك بالجزء العلوي من الفقرات الشوكية بملقط رمادي مسنن ، أدخل مقص الشاحنة المنحني من التيتانيوم مع الجانب المنحني لأعلى في العمود الفقري المكشوف في C واحد ، مع الحرص على عدم لمس الحبل الشوكي.

حرك المقص على طول الطريق إلى اليمين وقم بعمل قطع صغير واحد. يجب سماع صوت طحن صغير والشعور به عندما يقطع المقص الفقرات. كرر هذا القطع على أقصى الجانب الأيسر من السلك ، مع الحرص على عدم العمل بسرعة كبيرة جدا أو إجراء قطع كبير جدا ، لأن ذلك قد يخاطر بإتلاف السلك.

بمجرد قطع جوانب الفقرات ، يجب أن يكون اللاميني الفردي قادرا على الرفع بالملقط. كرر القطع اليمنى واليسرى لكل صفيحة حتى يتم الوصول إلى S أربعة. الاستمرار في إمساك فقرات الحبل الشوكي وسحبها للخلف.

قد تنفصل الفقرات الموجودة فوق عملية الزرع بمجرد قطع عموده الفقري إلى موقع الزرع. بمجرد قطع الفقرات إلى S أربعة ، ضع الفقرات لأسفل للمساعدة في تصور مكان موقع الزرع وقطع ما يقرب من 20 ملم منقاري ودلل إلى موقع الزرع. استخدم الآن مشرطا بشفرة رقم 11 لقطع العقد بعناية على يمين ويسار الجانب البطني من الحبل الشوكي ، بدءا من الطرف المنقاري.

ثم اقلب وحمله لأعلى بحيث يكون الحبل الشوكي متجها لأسفل واستخدم ملقطا مسننا مغلقا لتقشير الحبل الشوكي بعناية من نهاية التدليل. ثم دون قطع الحبل الشوكي ، قم بقطع أي من العقد المتبقية بعناية للسماح برفع الحبل الشوكي في قطعة واحدة سليمة ، وضع الحبل في وسط على الجليد لإعداد الحبل الشوكي للتصوير. انقل الأنسجة العصبية إلى ورقة من البارام بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى.

ثم قم بسحب ما يقرب من خمسة ملليلتر من محلول زراعي طازج 37 درجة مئوية ، 5٪ على السلك ، واتركه يتصلب في درجة حرارة الغرفة. بعد حوالي خمس دقائق ، ضع طبقة خفيفة من لاصق المناديل على زلة غطاء مربعة مقاس 22 ملم وقم بقلب الجانب البطني للحبل الشوكي المضمن لأسفل على قطعة جديدة من البيرفيل. قم بلصق زلة الغطاء على الجانب الظهري المكشوف واغمر المستحضر بالكامل في وسط جديد لترسيخ المادة اللاصقة.

ثم استخدم شفرة حلاقة لإزالة وردة آغا الصلبة الزائدة. بعد ذلك ، أدخل الأنبوب المتصل بمضخة الأنبوب في زجاجة وسائط ، محفوظة في حمام مائي لفتيل فائق 37 درجة مئوية. وسائط دافئة جدا من خلال بئر تصوير مصمم خصيصا على مرحلة المجهر بسرعة ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.

ثم ضع مستحضر الحبل الشوكي في البئر بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى نحو هدف الغمس 25 ×. لتصوير الحبل الشوكي البطني بواسطة منظارين مجهريين فوتونيين ، استخدم ليزر ياقوت من التيتانيوم فائق الضبط على 900 نانومتر مع قوة الليزر المخففة في العينة إلى أقل من 5٪ لضمان الحد الأدنى من السمية الضوئية. ثم باستخدام العدسة ومصدر ضوء المجال الساطع ، قم بتركيز هدف الغمس عند الحافة البطنية للحبل الشوكي.

لتعيين نقطة مرجعية، تأكد من إيقاف تشغيل مصدر الإضاءة المحيطة. ثم افتح غالق الليزر لتبديل الاقتباسين الضوئيين إن وجد. عند البحث في الأنسجة عن مجالات الاهتمام ، استخدم دقة أقل وإعداد مستوى صوت أعلى بدون تكبير رقمي ومعدل مسح أعلى مما هو عليه عند الحصول على الصور النهائية.

للعثور على الخلايا ، من الأفضل التركيز على العينة تحت إضاءة المجال الساطع عند حافة الأنسجة ، في موقع الزرع أولا ، ثم التبديل إلى التألق. يمكن بعد ذلك استخدام حقل X و Y كبير بدقة منخفضة لتمكين المشاهدة السريعة لمساحة كبيرة حيث يتحرك التركيز بشكل أعمق في الأنسجة. راقب محاور EYFP بالقرب من الحافة البطنية للحبل الشوكي.

الإشارة التوافقية الثانية من الكولاجين الذي لوحظ هنا باللون الأزرق هي الأكثر سطوعا عند حافة أنسجة الحبل الشوكي. الآن ، استخدم برنامج التقاط الصور المناسب للحصول على الصور النهائية عالية الدقة في مستويات بؤرية متسلسلة بزيادات قدرها 2.5 ميكرون لتجميع مكدسات Z. في هذا التمثيل ، لوحظت أن محاور YFP الزرقاء والتالفة يمكن إجراء تلوين زائف للأصفر لاحقا باستخدام برنامج التحرير ثم إجراء مسح ثنائي الاتجاه مع إزاحة الداخل المناسب لضمان القياس الكمي السريع لأي أجسام مهاجرة في الحبل الشوكي ، مما يضمن ضبط معدل إطار الاستحواذ المثالي لتحديد السرعة الخلوية داخل الحبل الشوكي على حوالي 1.7 إطار في الثانية.

أخيرا ، قم بتحليل ملفات الصور بسلاسة وألوان زائفة باستخدام البرنامج المناسب ، واستخدم العمليات الآلية لتمشيط أحجام التصوير المتتالية لإنتاج مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني النهائي. بينما يمكن استخدام بروتوكول تصوير الحبل الشوكي المزروع هذا لتصور أي تألق داخل الحبل الشوكي ، توضح هذه الصور تفاعلات الخلايا السليفة العصبية التمثيلية EGFP مع محاور EYFP في كومة Z واحدة داخل الحبل الشوكي البطني. يمكن بعد ذلك تجميع الاستحواذ على Zacks المتتالية لإنتاج مقاطع فيديو بفاصل زمني لتحليل الديناميكيات الخلوية في الوقت الفعلي داخل الأنسجة السليمة.

في الواقع ، يمكن أن يؤدي استخدام 520 نانومتر ثنائي اللون أحادي الحافة وفاصل شعاع ثنائي اللون أحادي الحافة 560 نانومتر إلى فصل إشارات EGFP و EYFP ، مما يسمح بالتلوين الزائف للقنوات الفردية باللونين الأخضر والأصفر باستخدام برنامج التصوير كما هو موضح هنا ، أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضمان الإزالة المناسبة للحبل الشوكي من الفأر دون تمدد مفرط ، ضغط أو قطع عرضي للأنسجة العصبية. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تصوير أي مجموعة من الخلايا أو المحاور المصنفة بالفلورسنت في الوقت الفعلي للإجابة على أسئلة إضافية ، بما في ذلك ما هي حركية الهجرة أو إعادة تكوين الميالين في ظل علاجات أو ظروف دوائية مختلفة.