إعداد وحيدة الخلية تعليق لتحليل Cytofluorimetric من المناطق الجلد ماوس مختلفة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير معلق خلية واحدة من جلد الفأر لتحديد المجموعات المختلفة للخلايا المناعية المقيمة عن طريق تحليل الفلور الخلوي. لتحديد وعزل السكان المختلفين للخلايا المناعية المقيمة في الجلد. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للباحثين بسهولة هضم العينات من مناطق مختلفة من جلد الفأر دون الإضرار بالخلايا المناعية ، صانعي سطح الاهتمام.

للحصول على عينات من الجلد من أذن الفأر ، قم بقطع الأجزاء الخالية من الشعر من الأذنين واستخدم الملقط لتفكيك الجانبين الظهري والبطني للأعضاء. ثم اكشط الأذن الداخلية برفق لإزالة أي غضروف متبقي. للحصول على عينات من الجلد ، احلق كل شعر باستخدام زوج من المقصات ، متبوعا بتطبيق غسول مزيل الشعر.

بعد بضع دقائق ، قم بتنظيف المستحضر وقم بعمل قطع رأسي في منتصف ظهر الفأر ، مع الاستمرار في الشق على طول حدود المناطق المحلوقة حول جسم الفأر. باستخدام ملقط لتثبيت الجلد في مكانه أثناء فصل العينة بأطراف مغلقة ومستديرة الحواف لزوج من المقص الجراحي أو المشرط ، افصل الجلد برفق عن عضلات الصفاق والظهر. ثم اغمر الجلد في صفيحة زراعة خلية مقاس 100 مم تحتوي على 10 مل من PBS المثلج واستخدم الملقط لكشط الدهون تحت الجلد.

للحصول على عينة من جلد الذيل ، اقطع الذيل واستخدم المقصا الجراحي لعمل قطع رأسي بدءا من قاعدة الذيل وصولا إلى الحافة. باستخدام الملقط ، أمسك حافة الشق في قاعدة الذيل ، ثم أمسك جسم الذيل بزوج آخر من الملقط ، واسحب الجلد برفق نحو الحافة. قم بإزالة أي دهون زائدة عن طريق كشط عينة الجلد برفق.

يتم قطع قدم الفأر ، ومن ثم للحصول على عينة من الجلد من وسادة القدم ، استخدم مقصا جراحيا لقص جلد القدم طوليا من الكاحل إلى بداية الأصابع ، مع الحرص على تجنب قص أي شعر. ثم أمسك عظام الكاحل بالملقط أثناء الإمساك بالجلد بالآخر واسحب الجلد نحو الأصابع كما هو الحال عند إزالة القفازات. لتسمية خلايا الجلد ، لكل عينة بدورها ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري بحجم 35 ملم يحتوي على 2 مل من كوكتيل الهضم الطازج.

باستخدام المقص ، قم بتقطيع العينة إلى قطع صغيرة واحتضان شظايا الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع هز لطيف واحد أو اثنين خلال فترة الحضانة. بعد ذلك ، اسكب أنسجة الجلد المهضومة على مصفاة خلية 70 ميكرون في طبق بتري 66 ملم يحتوي على 1 مليلتر من RPMI 1640 مكمل ب FBS لكل طبق. اغسل المصفاة بخمسة ملليلتر من الوسط الطازج ثم استخدم مكبس حقنة للضغط على العينات من خلال شبكة المصفاة.

اشطف المكبس والطبق والمصفاة ب 20 مل من الوسط الطازج وانقل ملاط الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد معالجة جميع العينات ، قم بالطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولتر لكل عينة من ميكروغرامين لكل ملليلتر من الجسم المضاد المضاد المضاد CD16 CD32 الذي يمنع في PBS بالإضافة إلى 1٪ FBS. بعد 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد كما هو موضح في الجدول إلى العينات المناسبة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من PBS بالإضافة إلى FBS وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من FBS PBS. ثم قم بتسمية الخلايا ب 2 ميكروغرام لكل مليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. لعزل الكريات البيض ، قم أولا ببوابة مجموعة DAPI الإيجابية للقضاء على الخلايا الميتة.

ثم حدد المفردات في منطقة التشتت الأمامية عن طريق مخطط عرض الانتثار الأمامي وبوابة الخلايا بناء على حجم ودقة الكريات البيض ذات الأهمية. بعد ذلك ، حدد الخلايا الموجبة CD45 ، ثم حدد لكل عينة مجموعات الخلايا المتغصنة للجلد من خلال تعبير CD11C و MHC من الفئة الثانية. حدد البلاعم من خلال تعبير CD64 و F480 ، والخلايا البائية من خلال تعبيرها من الفئة الثانية CD19 و MHC والخلايا التائية من خلال تعبير CD4 أو CD8.

ينتج عن عزل الخلايا المناعية للجلد كما هو موضح للتو مجموعة من الخلايا الأكثر حيوية من جميع مناطق الجلد ، بين 5،000 و 15،000 في المائة من السنتيمتر المربع منها إيجابية CD45. يمكن أيضا الحصول على عدد كاف من الخلايا المتغصنة والضامة والخلايا البائية والخلايا التائية لتحليلها من سنتيمتر مربع واحد من جلد الفأر ، كما هو موضح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية هضم أنسجة الجلد غير الملتهبة وعزل الكريات البيض لتحليل الفاكس.