طبيعي والخبيثة زرع العضلات خلية إلى المناعي للخطر اسماك الزرد الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تحضير وزراعة العضلات الطبيعية والخبيثة، من أسماك zebra fish مانحة معدلة وراثياً إلى أسماك zebra fish مستقبلة من سلالة rag two التي تعاني من نقص المناعة. تتضمن عملية زراعة العضلات أولاً عزل العضلات الموصومة فلورياً عن طريق تشريح العضلات الظهرية.

بعد التجانس، يتم ترشيح خلايا عضلات سمكة الزيبرا وتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة. ثم تُزرع الخلايا عضلياً في أسماك زيبرا طافرة من نوع rag two، ويُستخدم المجهر الفلوري فوق البنفسجي لتتبع تطعيم الأنسجة في الحيوانات المستقبلة في وقت مبكر يصل إلى 10 أيام بعد عملية الزرع. وبالمثل، يمكن حصاد ساركوما رابدومايوس جنينية أولية، وتحويلها إلى معلق، وزرعها داخل الصفاق في أسماك زيبرا طافرة من نوع rag two.

بعد ذلك، يُستخدم الفحص المجهري لمتابعة تطعيم الأنسجة، ويمكن الاستفادة من الخلايا الورمية المتكاثرة في تطبيقات لاحقة. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام نقل الخلايا إلى أسماك الزبرا البالغة ذات المناعة المنقوصة في توفير منصة عامة لنقل تبايني لعدة أنواع من الأنسجة والأورام. كما يمكن تطعيم الأنسجة من خلفيات جينية متنوعة للمانحين دون الحاجة إلى تثبيط المناعة في الأسماك المستقبلة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا الخلايا الجذعية والتجددية، مثل قدرة الخلايا السلفية على التجديد الذاتي. كما يمكننا استخدام هذه الطرق لزراعة الأورام في أسماك rag two الطافرة، ومن ثم تحديد مركبات كيميائية جديدة تعمل، على سبيل المثال، على كبح نمو الورم. سيقوم تشين وتانغ وأنيس بتوضيح تحضير وزراعة خلايا عضلية طبيعية وخبيثة. سيبدأ اثنان من طلاب الدراسات العليا الموهوبين في مختبر LAL بالتضحية بأسماك الزيبرا المانحة التي تحتوي على عضلات مmarkedة بفلورسنت. واحد.

تنتج أسماك المانح البالغة النموذجية من سلالة alpha acting RFP ما بين 500,000 إلى 2 مليون خلية عضلية. في تجربتنا المثالّية، نستخدم 30 سمكة مانحة للزرع في 20 سمكة مستقبلة بواقع مليون خلية لكل منها. بعد القتل الرحيم للأسماك المانحة، جفف الحيوان بوضعه على منشفة ورقية مخصصة للاستخدام مرة واحدة.

استخدم شفرة حلاقة لاستئصال العضلات الظهرية. يجب إجراء القطع بزاوية 45 درجة خلف منطقة الشرج، بما يشمل العظام وأنسجة الجلد. انقل 10 مقاطع عضلية ظهرية مستأصلة إلى طبق بتري نظيف. ثم أضف 500 µL من محلول Buffer المبرد المكون من 0.9 XPBS و5%FBS.

بعد ذلك، يتم فرم النسيج حتى يتم الحصول على معلق متجانس، مع تجنيس النسيج بالكامل باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 5 mL، ثم تضاف 2 mL من محلول التخفيف (suspension buffer) إلى المادة المتجانسة، ثم يتم تقليب المعلق عبر الماصة 20 مرة. بعد ذلك، يتم ترشيح المعلق باستخدام مصفاة بمسام 40 micron وتجميع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 mL على الثلج. يجب الحفاظ على برودة الخلايا طوال الفترة المتبقية من الإجراء.

اغسل الأنسجة المتبقية في المصفاة باستخدام 2.5 milliliters من محلول التعليق المنظم، ثم صَفِّها في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. والآن، قم بتعداد إجمالي عدد الخلايا الحية باستخدام trian blue، ثم ركزها عن طريق الطرد المركزي عند 1000 G لمدة 10 minutes عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 0.9 XPBS مع 5%FBS بكثافة 333,000 خلية لكل microliter.

إذا كان عدد الخلايا المانحة محدوداً، فإن حقن عدد قليل يصل إلى 50,000 خلية يمكن أن يؤدي أيضاً إلى تطعيم ناجح. ابدأ بتخدير أسماك rag two deficient التي يتراوح عمرها بين شهرين وأربعة أشهر باستخدام trica. عندما تصبح حركات الزعانف بطيئة وتستقر السمكة، انقلها إلى منشفة مبللة بحيث يكون الجانب الأيسر للسمكة موجهاً للأعلى.

الآن استخدم حقنة دقيقة سعة 10 µL مقاس 26 s ومُنظفة مسبقاً لحقن 3 µL من معلق الخلايا العضلية المُحضّر؛ يجب إتمام عمليات الحقن بزاوية 45 درجة وبشكل مباشر في العضلات الظهرية الجانبية للأسماك المستقبلة. ومن المهم ملاحظة أنه عند إجراء عملية الزرع داخل العضلات، يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي المحقون في الأسماك المستقبلة 3 µL. بعد ذلك، انقل الأسماك المستقبلة بعناية إلى خزان استشفاء يحتوي على مياه نظيفة من نظام تربية الأسماك.

استمر في حقن بقية الأسماك ووضعها في حوض استشفاء واحد. لاحقاً، قم بتقييم معدلات التطعيم بعد 10 و20 و30 يوماً من عملية الزرع باستخدام مجهر المجال المضيء والمجهر الفلوري فوق البؤري، مع معالجة كل ورم بشكل منفصل.

قم بتصريح سمكة مصابة بالسرطان العضلي المخطط الجنيني (embryonal rhabdomyosarcoma). ضع السمكة في طبق بتري نظيف واستأصل الورم بعيداً عن الأنسجة غير الخبيثة باستخدام شفرة حلاقة وملقط دقيق؛ حيث سيؤدي التشريح الدقيق حول الورم إلى الحصول على معلق خلوي بدرجة نقاء أعلى مع تقليل تلوث أنسجة العضلات المحيطة إلى أدنى حد. انقل الورم المستأصل إلى طبق جديد وأضف 100 µL من محلول منظم 0.9 XPBS 5%FBS المبرد مسبقاً.

ثم قم بتقطيع الأنسجة باستخدام شفرة حلاقة حتى يتم الحصول على معلق متجانس. بعد ذلك، أضف 900 µL إضافية من المنظم باستخدام ماصة سعة 1 mL، متبوعة بالتقليب. يتم تمرير المعلق عبر الماصة عدة مرات لفصل الخلايا.

قم الآن بترشيح الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسام 40 micron. اشطف الطبق بإضافة من 2 إلى 4 milliliters إضافية من المعلق والمحلول المنظم، ثم قم بالترشيح عبر مصفاة الخلايا نفسها. ركز الخلايا كما تم القيام به سابقاً.

احتفظ بالخلايا على الثلج. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 100 µL من المنظم وقم بتعداد الخلايا الحية باستخدام tripan blue. اضبط تركيز معلق الخلايا ليكون 5,000 خلية لكل µL.

بعد ذلك، قم بتخدير سمكتي الزيبرا المستقبلتين من سلالة rag two ناقصتي المناعة وضعهما على منشفة ورقية نظيفة بحيث يكون الجانب البطني للأعلى. وباستخدام إبرة حقنة مقاس 26 gauge نظيفة، احقن الحجم المطلوب في التجويف الصفاقي لسمكة الزيبرا المستقبلة هنا.

يتم حقن 25,000 خلية في 5 µL. ومع ذلك، يمكن حقن ما يصل إلى 10 µL بنجاح. اترك الأسماك المحقونة للتعافي في خزان استشفاء قبل إعادتها إلى النظام الرئيسي.

لاحقاً، يتم تتبع عملية التطعيم في الأسماك المستقبلة باستخدام مجهر الفلورسنس فوق البنفسجي، ثم يتم حصاد الخلايا لإجراء الدراسات اللاحقة. وباستخدام الإجراء الموصوف، تم نقل خلايا العضلات الهيكلية من متبرعين من نوع alpha actin RFP transgenic إلى أسماك زيبرا من طفرة rag two متماثلة الزيجوت ومثبطة مناعياً. وقد أنتج نسيج العضلات الهيكلية معلقاً من الخلايا المفردة يحتوي على 84.3% من الخلايا الحية وفقاً لتقييم DPI exclusion.

بعد تحليل قياس التدفق الخلوي، شكلت الخلايا الموجبة لبروتين RFP نسبة 35.3% من معلق خلايا المانح هذا. وأدى نقل الخلايا إلى العضلة الهيكلية الظهرية للأسماك المستقبلة ذات الطفرة متماثلة الزيجوت RAG two إلى تطعيم قوي ومتسق. تم تأكيد ذلك من خلال تكوين ألياف عضلية فلورية متعددة النوى في الأسماك المستقبلة، بينما فشلت الأسماك المستقبلة من النوع البري في تطعيم الألياف العضلية.

ومع ذلك، بحلول اليوم العاشر بعد الزرع، احتوت تسعة من أصل 14 سمكة زيبرا طافرة على ألياف عضلية موجبة لـ RFP بالقرب من موقع الحقن. والأهم من ذلك أن العضلات المطعمة الموجبة لـ RFP استمرت حتى اليوم 30 على الأقل بعد الزرع. وبالمثل، تم الحصول على تطعيم قوي بعد زرع خلايا من سرطان العضلات المخططة الجنيني أو ERMS في أسماك RAG two الطافرة.

تشاركت أورام ERMS المطعّمة في السمات النسيجية مع الورم الأولي لـ ERMS، كما تم الحفاظ على تباين الخلايا الورمية وفقاً لما تم تقييمه بواسطة تحليل الفلورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الزرع العضلي والزرع داخل الصفاق للأنسجة الطبيعية والخبيثة باستخدام أسماك بالغة مستلمة تعاني من نقص المناعة. بعد ذلك، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل فرز الخلايا المنشط بالفلورة، وتحليل الزرع بالتخفيف المحدود، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (real-time PCR) لتقييم الاختلافات الوظيفية والجزيئية بين المجموعات الفرعية المختلفة للأورام.

بشكل عام، يتيح نهجنا عملية تطعيم قوية وطويلة الأمد لأنسجة عضلية وأنسجة خبيثة فلورية في أسماك طافرة من سلالة RAG two تعاني من نقص المناعة. وتكمن ميزة هذا النهج في أن التطعيم يحدث دون الحاجة إلى تثبيط مناعي مسبق للأسماك المستقبلة، كما لا يتطلب تطابقاً مناعياً بين الحيوانات المانحة والمستقبلة.