استخدام الفئران محرض التيلوميراز الأليلات في الدراسات التي أجريت على الأنسجة تنكس / التجديد والسرطان

يلعب التيلومير والتيلوميراز أدوارا أساسية في الشيخوخة وتكوين الأورام. الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية توليد اثنين من أليلات التيلوميراز المحفزة للفئران وكيفية الاستفادة منها في دراسات تنكس / تجديد الأنسجة والسرطان.

الهدف العام من التجربة التالية هو التلاعب بأليلين محفزين للفئران في الجسم الحي وفي المختبر لدراسات تنكس الأنسجة وتجديدها ودراسات السرطان. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع أقراص هيدروكسي تاموكسيفين في لإعادة تنشيط الماسي في الجسم الحي. كخطوة ثانية ، يتم عزل الخلايا الجذعية العصبية عن التي يتم معالجتها بعد ذلك بهيدروكسي تاموكسيفين لإعادة تنشيط الميس في المختبر.

بعد ذلك ، يتم إجراء مضان التيلومير في C ، يتم إجراء التهجين أو الأسماك على كل من الخلايا المستزرعة وأنسجة المخ المضمنة في البارافين الرسمي والثابت من أجل التحقق من نشاط الماس. أظهرت النتائج أن علاجات هيدروكسي تاموكسيفين يمكن أن تعيد تنشيط نشاط الماس بقوة ، والتي يمكن أن تخفف من الأنماط الظاهرية للشيخوخة وتعزز تكوين الورم بناء على الفحص النسيجي المرضي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الشيخوخة والسرطان ، مثل ما إذا كان بإمكاننا إبطاء عملية الشيخوخة عن طريق تعديل نشاط صدمة TH أم لا ، أو كيفية استهداف توماس على وجه التحديد لعلاج السرطان.

سيوضح هذا الإجراء المدرب الدكتور تاكاشي شينغو وفني أبريل أون من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بتوليد Turt ER وقفل القفل أليلات turt كما هو موضح في بروتوكول النص ، وقم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الحقن لتخدير الفئران كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد الوصول إلى التخدير العميق ، قم بإزالة المخدر من غرفة الحث واحتفظ برأسه داخل الأنبوب المتصل بغرفة الفلور المتساوي .

اضغط على وسادات قدم الفئران للتأكد من تخدير بعمق. ضع أيضا مرهما على كلتا العينين من أجل منع العينين من الانسحاب ، امسح ظهر الفئران بمحلول اليود بوفيدون. بعد ذلك ، قم بحقن حبيبات هيدروكسي تاموكسيفين بطيئة الإطلاق بمبزل دقيق تحت جلد الظهر.

وادفع الحبيبات على طول الطريق إلى خط الوسط بين كتفين. أغلق الشق بمشبك الجرح وراقب الفئران للشفاء. للتخدير.

أخرج أدمغة الفئران ليوم واحد واحتفظ بالأدمغة الأربعة عن طريق إزالة البصيلات الشمية والمخيخ. احتفظ بأنسجة المخ الأربعة في ملليلتر واحد من وسط الثقافة الباردة ، وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. تأكد من معالجة الأنسجة العصبية في غضون ساعة واحدة.

حدد وزن الأنسجة للتأكد من عدم تجاوز حد 400 ملليغرام لكل عملية هضم. ضع الدماغ على غطاء طبق بتري قطره 35 ملم وسحق الدماغ باستخدام مشرط. باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد ، أضف ملليلترا واحدا من محلول ملح توازن هانك أو HBSS.

ثم قم بإعادة الماصة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر بعد شطفها باستخدام جهاز طرد مركزي HBSS عند 300 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية بعناية ، أضف 1،950 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا. امزج واحدا لكل 400 ملليغرام من الأنسجة.

احتضان العينة في أنبوب سعة 15 مليلتر لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. امزج العينة عن طريق قلب الأنبوب أو هزه كل خمس دقائق. ثم قم بإعداد 30 ميكرولترا من الإنزيم امزج اثنين لكل عينة من الأنسجة بإضافة 20 ميكرولترا من المحلول ، وثلاثة إلى 10 ميكرولترات من المحلول أربعة.

ثم أضفه إلى العينة ، مع التقليب برفق للخلط ، وفصل الأنسجة ميكانيكيا باستخدام ماصة معجون مصقولة ذات رؤوس عريضة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، مع قلب الأنبوب كل ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بتطبيق تعليق الخلية على مصفاة خلية 70 ميكرون موضوعة على أنبوب سعة 50 مل.

ضع 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS من خلال مصفاة الخلية. ثم تخلص من مصفاة الخلية وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 مرة G لمدة 20 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية بالكامل.

قم بإعادة تعليق الخلايا ذات الوسط الخلوي الجذعي إلى الحجم المطلوب لمزيد من التطبيقات لتنشيط المصفوفة عن بعد في الأقفال ، وإيقاف الأقفال. الخلايا الجذعية العصبية العنقية. عالج الخلايا ب 100 ميكرومولار هيدروكسي تاموكسيفين لمدة يومين لتنشيط الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الجذعية العصبية.

احتفظ بالخلايا في وسط استزراع مع 100 ميكرومولار هيدروكسي تاموكسيفين لأداء أسماك التيلومير. أولا ، قم بإعداد كروموسومات الطور من الخلايا المستزرعة لأقسام الأنسجة الثابتة للفورمالين والبارافين المدمج أو أقسام الأنسجة FFPE. قم بتقسيم العينة في الزيلين وأعد ترطيبها في سلسلة من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل منها وفي PBS لمدة خمس دقائق.

ثم بعد تثبيت الأقسام بنسبة ثلاثة إلى واحد من الميثانول إلى حمض الأسيتيك لمدة ساعة إلى ساعتين. قم بتجفيف الأقسام في سلسلة الإيثانول البارد لمدة خمس دقائق لكل منها وغسلها بالهواء الجاف في XPBS واحد عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. التالي في الطبيعة ، الكروموسومات في 4٪ فورمالديهايد عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

قم بتجفيف الأقسام في سلسلة الإيثانول البارد كما كان من قبل وجففها في الهواء بمجرد أن تجف ، ضع 12 إلى 25 ميكرولترا من خليط تهجين الحمض النووي الببتيد على كل شريحة. أغلق زلة الغطاء بالأسمنت المطاطي الذي يضع التحضير الكروموسومي الطبيعي وأقسام الأنسجة عند 80 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. ثم تهجين في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في غرفة رطبة.

بعد ذلك ، اغسل العينات في درجة حرارة الغرفة باستخدام عازلة الغسيل لمدة 15 دقيقة مرتين. ثم اغسلها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق باستخدام PBS و tween 23 مرة. أخيرا ، قم بإزالة الشرائح باستخدام DPI أو التألق الأحمر البعيد للفحص المجهري.

عندما يتم إعادة تنشيط التيلومير بشكل عابر في الفئران المختلة وظيفيا ، يمكن تحسين الأنماط الظاهرية التنكسية في أعضاء متعددة مثل الدماغ والخصيتين لتحديد تأثير إعادة تنشيط التيلومير على الخلايا. تم عزل الخلايا الجذعية العصبية المستنبتة في المختبر من الجيل المتأخر من أقفال G الأربعة قفل ، و TURT و G أربعة فئران ER. عندما أعيد تنشيط التيلومير في الخلايا الجذعية العصبية المختلة وظيفيا ، زادت قدرة التجديد الذاتي بشكل كبير.

كما تم تعزيز تكوين الخلايا العصبية في المختبر بشكل كبير لتحديد تأثير إعادة تنشيط الورم على تكوين الورم في سياق الخلل الوظيفي في التيلومير ، وتم إجراء إعادة تنشيط الماس عن طريق علاج تاموكسيفين في نموذج ورم البروستاتا. نموذج لمفومة الخلايا التائية Endot thic. أدى العلاج إلى تحسين تكوين الورم بشكل كبير في كلا النموذجين.

أخيرا ، تم إجراء أسماك التيلومير على FFPE وأنسجة دماغ الفأر والكروموسومات الطورية. في هذه الصور ، يشير اللون الأحمر إلى اللون الأخضر للحمض النووي يشير إلى تلطيخ التيلومير ، ويشير السماوي إلى تلطيخ السنترومير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنشيط نشاط الصدمة في mTOR ER وأقفال إيقاف القفل mTOR وخطوط الخلايا ، وكيفية استخدامها لدراسة أسئلتك في السرطان والعامل.