المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

الهدف العام من التجربة التالية هو تتبع هجرة وتفاعل الكريات البيضاء في مرض التهاب الكبد المتقدم، وذلك لفهم تسلسل الأحداث الكامنة وراء كيفية استقطاب هذه الخلايا إلى أنسجة الكبد ومدى مشاركتها المحتملة في الاعتلال المناعي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء عملية بضع الرغامي للتحكم في تنفس الفأر، وهي خطوة حاسمة لضمان بقاء الحيوان على قيد الحياة لفترة طويلة.

كخطوة ثانية، يتم إجراء عملية فتح بطن للفأر للكشف جراحياً عن الكبد، مما يتيح الوصول إلى العضو باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. بعد ذلك، يتم تثبيت الكبد وتحديد موضعه عن طريق غمره في مادة الـ rose لتقليل آثار الحركة الاصطناعية. يمكن إجراء التصوير على مدار عدة ساعات، مما يؤدي إلى الحصول على تسلسلات زمنية عالية الدقة تتبع التغيرات في استقطاب وتمركز وتفاعل خلايا leukocytes الفردية.

في سياق تطوير التهاب الكبد، يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التهاب الكبد الحاد والمزمن، مثل تجنيد الكريات البيضاء، أو التفاعلات بين الخلايا، أو آليات الاعتلال المناعي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالمجهر التقليدي في أن المجهر متعدد البؤر يتيح التصوير طويل الأمد دون إحداث أي اضطراب فعلي في العينة، مع انخفاض في التبييض البؤري أو السُمية الضوئية، بالإضافة إلى إمكانية الحصول على شرائح بصرية بعمق يصل إلى 100 micrometer داخل النسيج، وذلك بفضل الخصائص الفيزيائية الفريدة لليزر الضوء الأحمر البعيد. وبناءً على ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى معمقة حول أمراض الكبد.

يمكن تطبيقه بسهولة على أنظمة أخرى. وبفضل طريقة التثبيت والترسيخ، يمكن تطبيق هذه التقنية على جميع تساؤلات المجهر الحيوي (intravital microscopy) تقريبًا، لذا يمكنها تصوير أعضاء مثل الطحال أو الكلية أو حتى الأورام تحت الجلد باستخدام الخلايا ذات الصلة والنشطة. كما يمكن أيضًا تصور جميع المجموعات الفرعية من الكريات البيضاء ورصد تفاعلاتها والتهابات الكبد.

عموماً، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب التعقيد الشديد لجراحة الحيوانات الصغيرة. ومع ذلك، وبناءً على خبرتنا، فإن هذا يمثل عاملاً مقيداً لبضعة أسابيع فقط، ويتطلب مجرد بعض التدريب العملي الروتيني. ونظراً لهشاشة أنسجة الكبد، فإن خطوات التحضير يصعب تعلمها، لذا يعد العرض المرئي للطريقة أمراً ضرورياً. بعد إعداد التخدير، املأ مسرح عملية الفأر بـ 3% aros، مع صبها بزاوية 40 درجة.

بعد ذلك، تأكد من تعقيم منطقة العمل الجراحية بالكامل، وكذلك جميع الأدوات المطلوبة وما إلى ذلك. ثم قم بتخدير الفأر عن طريق حقن مزيج تخدير داخل الصفاق. وبعد مرور خمس دقائق، افحص ردود أفعال الحيوان، ثم قم بتطهير الجلد ووضع مرهم عيني على العينين.

الآن، قم بتثبيت الفأر على طاولة التحضير. وباستخدام الشريط اللاصق، ضع الفأر بحيث يكون الجانب البطني مكشوفاً مع تمديد الرقبة بلطف. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام رباط مطاطي يتم تعليقه في القواطع.

الآن، قم بإجراء الشق الأولي أسفل الذقن بطول يتراوح بين 0.5 إلى 1 سم تقريباً. ثم قم بتشريح النسيج الضام بين الغدد اللعابية بعناية وابحث عن الأنبوب العضلي المحيط بالرغامي. قم بتمزيق العضلة برفق للكشف عن الرغامي.

اسحب خيطاً تحت الرغامى، ثم افتح الرغامى باستخدام مقص دقيق عن طريق إجراء شق على شكل حرف T داخل الشق الأساسي. أدخل أنبوب التهوية لمسافة نصف سنتيمتر تقريباً. قم بدفع الأنبوب للأمام باستخدام ملقط تشريحي صغير.

بعد ذلك، يتم تثبيت الأنبوب باستخدام الغرز الجراحية. ولزيادة التأمين، تُخاط الأنبوب بالجلد، ويُغلق الشق الجلدي باستخدام cyanoacrylate، ثم يُثبت الأنبوب برأس الحيوان. وباستخدام شريط لاصق، يتم الحفاظ على التخدير عن طريق التدفق المستمر لـ 2%iso fluorine.

بعد تحضير الفأر للجراحة، قم بعمل شق جلدي صغير أسفل عظمة القص ومدد القطع جانبيًا أسفل الأضلاع على كلا الجانبين. قم بكي جميع الأوعية الدموية المكشوفة خلال هذه العملية. وللحد من النزيف، قم بإجراء قطع أولي صغير عند المرفق الخطي للوصول إلى التجويف البطني.

قم بتوسيع الشق أفقيًا، مع كيّ جميع الأوعية الدموية للوصول إلى الكبد. الآن، انقل الفأر إلى منصة التثبيت وقم بوضع شرائح زجاجية على جانبي الحيوان للمساعدة في تثبيته في مكانه. يجب أن تتطابق هذه الشرائح مع ارتفاع الفأر بحيث لا تضغط منصة الكبد، التي سيتم وضعها لاحقًا، بشكل مفرط على منطقة البطن.

الآن، وباستخدام الغرز في عظمة القص، قم بإبعاد الضلوع. ستكون غرزة 4-0 كافية. بعد إبعاد الضلوع، اقطع الأربطة التي تربط الكبد والحجاب الحاجز، وقم بالقطع وصولاً إلى الأبهر، ولكن تعامل بحذر شديد لتجنب تمزيق أو قطع الوعاء الدموي. اقطع أيضاً الرباط الذي يربط الكبد بالجهاز الهضمي.

قم بتدوير الفأر بزاوية 45 درجة لتحسين الوصول إلى فص الكبد الأكبر. أحضر شريحة غطاء قياسية وثبّتها بشريط لاصق على طول حوافها بحيث لا تكون حادة. ضعها فوق التجويف البطني.

سيعمل هذا كقاعدة لوضع الكبد عليها. مرر بعناية مسباراً ذا رأس كروي مزدوج، أو ملعقة مسطحة مبطنة أسفل الكبد وأمسك بالجزء العلوي من العضو. باستخدام منديل مبلل، يمكن للضغط الميكانيكي أن يتسبب فوراً في إصابة أنسجة الكبد، لذا من الضروري التعامل مع العضو بحذر.

ثم ارفع الفص وضعه على الشريحة واسحبه برفق لضبط موضعه. عادةً ما ينتهي الأمر بالفص منحنياً أو مطوياً، لذا حاول فرد الحواف برفق عن طريق رفع النسيج باستخدام ملعقة مسطحة رقيقة أو منديل مبلل. بعد ذلك، أضف دعامات جانبية على شكل شرائح تغطية أو شرائح زجاجية.

قم برص أغطية الشرائح لتكون بنفس ارتفاع فص الكبد. تعد مرحلتا التثبيت والتثبيت الكيميائي للكبد الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول؛ حيث أن أي إجهاد ميكانيكي أو التواء أو ضغط سيؤدي إلى تلف فوري في الأنسجة أو على الأقل ضعف في تدفق الدم في الأوعية الجيبية.

الآن، ضع غطاء شريحة كبيراً ذات حواف مثبتة بشريط لاصق فوق فص الكبد المدعوم بالدعامات الجانبية. ضع غطاء الشريحة هذا بحيث يكون مستوياً قدر الإمكان، مع مراعاة ألا يضغط على الكبد.

يشير اللون الأبيض في الأنسجة إلى ضعف تدفق الدم ما لم تكن عملية التصوير سريعة. من الضروري الآن إدخال قسطرتين مستقلتين داخل الصفاق لتوفير التخدير طويل الأمد وتطبيق G five. يتم تجميع هذه القسطرات من إبر عيار 27 وأنابيب سيليكون مرنة.

ثم ابدأ تدفقها باستخدام مضخات الحقن. أدخل القساطر في أسفل البطن بالقرب من الأطراف الخلفية. بعد توصيل أجهزة مراقبة المؤشرات الحيوية بالفأر، قم بتحضير 100 milliliters من 3%aros في one XPBS.

عندما يبرد الـ aros إلى 41 درجة Celsius، قم بتضمين الكبد فيه باستخدام محقنة سعة 5 mL مع إبرة قياس 18 gauge. وبمجرد أن يبرد الـ aeros، استخدم ملعقة heideman لإزالة الزوائد وكشف مجال رؤية واسع بما يكفي لفحص الكبد. ثم ابدأ بعملية الفحص.

بعد تجهيز مجال الرؤية، حرك الفأر تحت المجهر لتحديد مناطق المسح المناسبة للتصوير بفاصل زمني. يتم مسح أنسجة الكبد بصرياً باستخدام مصدر ضوء أبيض خارجي لتحديد المجالات التمثيلية التي تتميز بتدفق دم كافٍ وأدنى قدر من الاضطراب في العينة. خضعت الفئران متغايرة الزيجوت لـ CXCR six GFP لتصوير T-P-L-S-M حي داخل الجسم كجزء من التجربة، حيث حُقن بعضها بـ tetrachloride عن طريق الصفاق لاستحثاث تلف كبدي حاد.

تم تتبع الخلايا المودالية التي تعبر عن GFP بواسطة الفيديو، ثم دُمجت مساراتها للحصول على لقطة فورية للحركية الخلوية. بعد ذلك، تم تطبيع هذه المسارات. وقد أظهرت الأكباد الطبيعية خلايا ذات أنماط هجرة عشوائية.

أظهرت الأكباد التي حُقنت بـ CCI four ضعفاً في الهجرة الخلوية. وعند قياس الإزاحة الكلية من نقطة الأصل، كان من الواضح حدوث احتجاز للخلايا بعد 36 ساعة من العلاج بـ CCI four في موقع التلف الكبدي. كما يمكن إثبات ضعف الهجرة الناتج عن تلف الكبد من خلال رسم سرعة هجرة الخلايا الفردية بمرور الوقت، مما يظهر توقفاً جزئياً بعد 18 ساعة وتوقفاً تاماً للهجرة بعد 36 ساعة.

ويمكن أيضاً إثبات أن الانخفاض في سرعة الخلايا المهاجرة كان ذا دلالة إحصائية عند مقارنة الخلايا كمجموعات. وبالتالي، فإن هذا النهج مناسب لتتبع التغيرات في هجرة الخلايا وتمركزها في أمراض الكبد النامية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير كبد الفأر للفحص بالمجهر متعدد الفوتونات الحي.

تتيح لنا الطريقة المقدمة هنا تثبيت الحيوان لضمان بقائه على قيد الحياة لفترة طويلة، بالإضافة إلى تقليل الشوائب الناتجة عن الحركة بفضل طريقة التثبيت اللطيفة التي نوفرها. وبمجرد التخدير، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعة واحدة تقريبًا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ومن المهم خلال هذا الإجراء مراقبة المؤشرات الحيوية للحيوانات، بما في ذلك درجة الحرارة، ومعدل ضربات القلب، ومستويات الأكسجين و CO2، ويمكن تحقيق ذلك من خلال ضبط عمق التخدير والتنفس باتباع هذه التقنية.

يمكن إجراء إجراءات أخرى مثل تحليل قياس التدفق الخلوي أو التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري للإجابة على أسئلة إضافية مثل النمط الظاهري للخلايا المناعية المرتشحة أو الوسائط التي تفرزها الأنسجة أو الخلايا المرتشحة بعد تطورها. سمحت هذه التقنيات للباحثين باكتساب رؤى حول ديناميكيات حركة الكريات البيضاء والتفاعلات الخلوية في الكبد، مما أتاح تحليل تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى أمراض الكبد الالتهابية. يرجى اتباع إرشادات السلامة الليزرية عند إجراء التصوير باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء ذو النبضات عالية الطاقة المستخدم في المجهر متعدد الفوتونات.

تأكد من عدم إمكانية تسبب أي انعكاس لإشعاع الليزر في حدوث خطر على عينيك وبشرتك أثناء إجراء هذه التجربة.