المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

الهدف العام من التجربة التالية هو متابعة هجرة وتفاعل الكريات البيض في تطور مرض التهاب الكبد. لفهم تسلسل الأحداث الكامنة وراء كيفية تجنيد هذه الخلايا في أنسجة الكبد بشكل أفضل ومشاركتها المحتملة في علم الأمراض المناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء بضع القصبة الهوائية أولا للسيطرة على تنفس الفأر ، وهي خطوة حاسمة لضمان بقاء على المدى الطويل.

كخطوة ثانية ، يقوم الفأر بقطع البطن لفضح الكبد جراحيا ، مما يتيح الوصول إلى العضو باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. بعد ذلك ، يتم تثبيت الكبد ووضعه عن طريق تضمينه في نشأة لتقليل القطع الأثرية للحركة. يمكن إجراء التصوير على مدى عدة ساعات مما يؤدي إلى تسلسلات عالية الدقة وفاصل زمني تتبع التغييرات في التجنيد وتحديد المواقع وتفاعل الكريات البيض الفردية.

في عملية تطوير التهاب الكبد ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التهاب الكبد الحاد والمزمن ، مثل تجنيد الكريات البيض ، أو تفاعلات الخلايا الخلوية ، أو آليات علم الأمراض المناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالفحص المجهري التقليدي هي أن الفحص المجهري متعدد البؤر يسمح بالتصوير طويل الأمد مع عدم وجود اضطراب في العينة تقريبا مع تبييض منخفض للمهر أو سمية ضوئية ، بالإضافة إلى شرائح بصرية يصل عمقها إلى 100 ميكرومتر في الأنسجة ، ويرجع ذلك إلى الفيزياء الفريدة لليزر لضوء الليزر الأحمر البعيد. حسنا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لأمراض الكبد.

يمكن اعتماده بسهولة على أنظمة أخرى. منذ طريقة التثبيت والتثبيت ، يمكن تطبيق الأنسجة على جميع أسئلة الفحص المجهري داخل الحيوية تقريبا ، بحيث يمكنها بسهولة تصوير أعضاء مثل الطحال أو الكلى أو حتى الأورام تحت الجلد باستخدام الخلايا ذات الصلة بطلاقة. من الممكن أيضا تصور جميع المجموعات الفرعية للكريات البيض وإرسال تفاعلاتها والتهاب الكبد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التعقيد الشديد لجراحة الصغيرة. ومع ذلك ، نظرا لتجربتنا الخاصة ، فإن هذا ليس سوى عامل مقيد لبضعة أسابيع ويحتاج فقط إلى بعض الأيدي في الروتين نظرا لهشاشة أنسجة الكبد ، يصعب تعلم خطوات التحضير ، والعرض المرئي للطريقة ضروري. بعد إعداد التخدير ، املأ مرحلة الماوس ب 3٪ aros ، واسكبها بزاوية 40 درجة.

ثم تأكد من تطهير منطقة العمل الجراحية بالكامل ، وكذلك جميع الأدوات المطلوبة وما إلى ذلك. ثم تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من كوكتيل مخدر. بعد خمس دقائق ، تحقق من ردود أفعال ثم قم بتطهير الجلد ووضع مرهم للعيون على العينين.

الآن ، قم بتأمين الماوس على طاولة التحضير. باستخدام شريط لاصق ، ضعه لكشف الجانب البطني برفق مما يؤدي إلى شد الرقبة برفق. يمكن للشريط المطاطي المثبت على القواطع تحقيق ذلك.

الآن ، قم بإجراء الشق الأولي أسفل الذقن بطول حوالي 0.5 إلى سنتيمتر واحد. ثم قم بتشريح النسيج الضام بين الغدد اللعابية بعناية وابحث عن الأنبوب العضلي المحيط بالقصبة الهوائية. قم بتمزيق العضلات برفق لفضح القصبة الهوائية.

اسحب خيطا أسفل القصبة الهوائية ، ثم افتح القصبة الهوائية بمقص صغير باستخدام شق على شكل حرف T في الشق. أدخل أنبوب التهوية حوالي نصف سنتيمتر. تقدم الأنبوب باستخدام ملقط تشريحي صغير.

ثم قم بتأمين الأنبوب بالخيوط. ثم لمزيد من الأمان ، قم بخياطة الأنبوب على الجلد ، وأغلق الشق في الجلد باستخدام cyanoacrylate وقم بتأمين الأنبوب على رأس. باستخدام شريط لاصق ، حافظ على التخدير باستخدام تدفق مستمر من 2٪ iso fluorine.

بعد تحضير الفأر للجراحة ، قم بعمل شق جلدي صغير أسفل القص وقم بتمديد الجرح بشكل جانبي أسفل الأضلاع على كلا الجانبين. كي جميع الأوعية الدموية المكشوفة في هذه العملية. لتقليل النزيف ، قم بإجراء قطع أولي صغير في الكوع الخطي للوصول إلى تجويف البطن.

قم بتمديد القطع أفقيا ، وإغلاق جميع الأوعية الدموية وإتاحة الوصول إلى الكبد. الآن ، انقل الماوس إلى المرحلة الزراعية وقم بتكديس الشرائح على جانبي للمساعدة في إبقائه في مكانه. يجب أن تتطابق هذه الأكوام مع ارتفاع الماوس بحيث لا تمارس مرحلة الكبد ، التي سيتم وضعها لاحقا ، ضغطا مفرطا على البطن.

الآن ، باستخدام الغرز في القص ، اسحب الأضلاع. أربعة خياطة صفرية تكفي بعد سحب الأضلاع ، قم بقطع الأربطة التي تربط الكبد والحجاب الحاجز على طول الطريق إلى الشريان الأورطي ، ولكن اعمل بحذر شديد حتى لا تمزق أو تقطع الوعاء. قم أيضا بقطع الرباط الذي يربط الكبد والجهاز الهضمي.

أدر الماوس 45 درجة لتحسين الوصول إلى فص الكبد الأكبر. خذ زلة غطاء قياسية وقم بلصقها على طول حوافها بحيث لا تكون حادة. ضعه فوق تجويف البطن.

سيكون هذا بمثابة مرحلة للكبد لوضع الكبد على المسرح. قم بتحريك مسبار قلم كروي مزدوج بعناية ، أو ملعقة مبطنة أسفل الكبد وأمسك الجزء العلوي من العضو. سيؤدي استخدام ضغط ميكانيكي للأنسجة الرطبة إلى إصابة أنسجة الكبد على الفور ، لذلك من الضروري التعامل مع العضو بحذر.

ثم ارفع الفص على الشريحة واسحبه برفق إلى موضعه. عادة ما ينتهي الأمر بالفص بالانحناء أو الطي برفق ، في محاولة لفتح الحواف عن طريق رفع الأنسجة بملعقة رفيعة أو منديل رطب. بعد ذلك ، أضف دعامات جانبية في شكل زلات غطاء أو شرائح.

قم بتكديس زلات الغطاء لتكون بنفس ارتفاع فص الكبد. يعد التدريج وتثبيت الكبد الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. سيؤدي أي إجهاد ميكانيكي أو التواء أو ضغط إلى تلف فوري للأنسجة أو على الأقل ضعف تدفق الدم في الأوعية الجيبية.

الآن ، ضع زلة غطاء كبيرة مع حواف مسجلة فوق فص الكبد مدعومة بالدعامات الجانبية. ضع زلة الغطاء هذه في أقصى مستوى ممكن. لا ينبغي أن تضغط على الكبد.

تشير الأنسجة البيضاء إلى ضعف تدفق الدم ما لم يتم التصوير بسرعة. من الضروري الآن إدخال قسطرتين مستقلتين داخل الصفاق لتوفير تخدير طويل الأمد وتطبيق G خمسة. يتم تجميعها من إبر قياس 27 وأنابيب سيليكون مرنة.

ثم ابدأ تدفقها باستخدام مضخات الحقنة. أدخل القسطرة في أسفل البطن بالقرب من الأطراف الخلفية. بعد توصيل الشاشات الحيوية بالماوس ، قم بإعداد 100 مل من 3٪ aros في XPBS واحد.

عندما يبرد الحروس إلى 41 درجة مئوية ، قم بتضمين الكبد فيه باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر بإبرة قياس 18. بمجرد أن يبرد الهواء ، استخدم ملعقة هايدمان لإزالة الفائض وكشف مجال رؤية كبير بما يكفي لمسح الكبد. ثم تابع المسح.

بعد إعداد مجال الرؤية، حرك الماوس أسفل المجهر لتحديد مناطق المسح المناسبة للتصوير بفاصل زمني. يتم مسح أنسجة الكبد بالعين باستخدام مصدر ضوء أبيض خارجي يحدد الحقول التمثيلية ذات تدفق الدم الكافي والحد الأدنى من اضطراب العينة CXCR تعرضت ستة فئران متغايرة الزيجوت GFP لتصوير T-P-L-S-M داخل الحيوية كتجربة. تم إعطاء البعض حقنة داخل الصفاق من رابع كلوريد للحث على تلف حاد في الكبد.

تم تتبع الخلايا المشروطة التي تعبر عن GFP عن طريق الفيديو وتم تركيب مساراتها للحصول على لقطة من التنقل الخلوي. ثم تم تطبيع المسارات. كان للكبد الطبيعي خلايا ذات أنماط هجرة عشوائية.

أظهرت الكبد المحقون ب CCI أربعة ضعفا في الهجرة الخلوية. بقياس الإزاحة الكلية من أصلها ، كان من الواضح أنه كان هناك محاصرة للخلايا بعد 36 ساعة من علاج CCI الرابع في موقع تلف الخلايا الكبدية. يمكن أيضا إظهار ضعف الهجرة عن طريق تلف الكبد من خلال رسم سرعة هجرة الخلايا الفردية بمرور الوقت ، وإظهار التوقف الجزئي بعد 18 ساعة وتوقف الهجرة الكامل بعد 36 ساعة.

يمكن أيضا إثبات أن الانخفاض في سرعة الخلايا المهاجرة له دلالة إحصائية عند مقارنة الخلايا كمجموعات. وبالتالي ، فإن هذا النهج مناسب لتتبع التغيرات في هجرة الخلايا وتحديد المواقع في الإصابة بأمراض الكبد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير كبد الفأر للفحص المجهري متعدد الصور الحيوية الحيوية.

لنا الطريقة التي نقدمها هنا بتثبيت من أجل البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل بالإضافة إلى تقليل القطع الأثرية للحركة بسبب طريقة التثبيت اللطيفة التي نقدمها. بمجرد إقناعها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة واحدة تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح خلال هذا الإجراء ، من المهم التحكم في المعلمات الحيوية للحيوانات التي تعمل على استقرار درجة الحرارة ومعدل ضربات القلب والأكسجين وثاني أكسيد الكربون2. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تكييف عمق النخر والتنفس باتباع هذه التقنية.

يمكن إجراء إجراءات أخرى مثل تحليل قياس التدفق الخلوي أو التشريح الدقيق للالتقاط بالليزر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل النمط الظاهري للخلايا المناعية المتسللة أو الوسطاء الذين تفرزهم الأنسجة أو الخلايا المتسللة بعد تطورها. سمحت هذه التقنيات للباحثين باكتساب نظرة ثاقبة لديناميكيات حركة الكريات البيض والتفاعلات الخلوية في الكبد ، مما يسمح بتشريح تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى أمراض الكبد الالتهابية. يرجى اتباع إرشادات أمان الليزر التي تقوم بالتصوير باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي عالي الطاقة المستخدم في الفحص المجهري متعدد الصور.

تأكد من عدم وجود انعكاس لإشعاع الليزر يمكن أن يسبب خطرا على عينيك وجلدك أثناء إجراء هذه التجربة.