3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الخلايا الصعترية أو النخاعية أو الظهارية أو mtech في ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد أو نظام OTC. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع مادة السقالة الليفية أولا في ملحق مرشح 12 بئر ، متبوعا بطبقات من هلام الفيبرين المحضر حديثا يحتوي على الخلايا الليفية لجلد الإنسان. بعد أربعة إلى خمسة أيام من الزراعة المسبقة ، يتم جلوس MTS على السقالة وزراعتها في ظروف الاستزراع المغمورة.

في النهاية ، يمكن إجراء الكيمياء المناعية وعزل الحمض النووي الريبي والحقائق على الثقافات المشتركة لتقييم تطور CED Mtech. تتمثل الميزة الرئيسية لأنظمة الزراعة العضوية المشتركة ثلاثية الأبعاد مقابل أنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد الحالية في أنها متفوقة بكثير في تلخيص تمايز mtech والانتشار والحفاظ على التعبير الجيني المختلط. اليوم ستظهر هذه التقنية إيريس مارتن ، فنية من مختبرنا التعاوني.

عندما تصل الخلايا الليفية الجلدية البشرية إلى الطلاقة المشتركة ، قم بإعداد ألياف السقالة عن طريق غلي وتجفيف وكي القطع التي يتراوح سمكها من 0.4 إلى 0.6 ملم من مادة الألياف غير المنسوجة من فيسكو. استخدم ثقب معدني لتقطيعها إلى دوائر 11 ملم. ضع المادة الليفية المقطوعة بين شريحتين ، ولف الشرائح بورق الألمنيوم وقم بالتعقيم فيها.

بمجرد التعقيم ، ضع الإدخالات في آبار من صفيحة معقمة 12 بئر ، ثم كل سقالة في ملحق مقابل. بعد ذلك ، امزج ، 2.7 مرة 10 إلى الخلايا الليفية الخامسة في 100 ميكرولتر من مصل ربلة الساق الجنينية في 100 ميكرولتر من الثرومبين المخفف حديثا لكل سقالة. قم بتوزيع خليط الخلايا الليفية الثرومبين على كل سقالة ، متبوعا ب 200 ميكرولتر من الفيبرينوجين المخفف حديثا.

ثم اخلطي خليط الخلية داخل كل بئر ، ووزعي المحلول بالتساوي على السقالة بأكملها مع ماصة لطيفة. تظهر الصورة نمو الخلايا الليفية الجلدية البشرية مع هلام الفيبرين في اليوم الأول واليوم الرابع من الثقافة. قم بإعداد جل اختبار في بئر تحكم بدون سقالة لتتبع وقت وتكوين الجلطات في هذا الوقت أيضا.

قم بتقييم تكوين الجلطة باستخدام طرف ماصة أو عن طريق قلب الصفيحة بعد الخلايا الليفية ، وغمر مزارع الأعضاء في وسط ، مع استكمال حمض السوربيك و TGF beta واحد لمدة أربعة إلى خمسة أيام في يوم البذر mtech ، استبدل هذا الوسيط بوسط RFAD يحتوي على 500 وحدة لكل مليلتر من البروتين لمنع انحلال الفيبرين المبكر. بعد سبع إلى ثماني ساعات ، علقت البذور 2.5 مرة 10 إلى MT E الخامس في 100 ميكرولتر من RFAD على الجزء العلوي من كل سقالة ، ولاحتضان الثقافات المشتركة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط جديد يحتوي على 250 وحدة لكل مليلتر من البروين لمدة أربعة إلى سبعة أيام أخرى من الاستزراع.

لتقييم تطور m Texs عن طريق الكيمياء المناعية في نهاية الثقافة ، استخدم زوجا من الملقط لفصل المكافئ الجلدي للسقالة عن مرشح كل منهما. قم بإدراج وتضمين OTCs في مركب OCT. قم بتجميد OTCs في الطور الغازي فوق النيتروجين السائل لعزل O-T-C-R-N-A.

بعد فصل أنسجة السقالة عن المرشحات ، استخدم مشرطا لتقطيع OTCs إلى قطع ونقل القطع إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي ملليلتر يحتوي على مليلتر واحد من محلول تغيير الطبيعة. باستخدام أداة إعداد سريعة ، قم بتمزيق OTCs ميكانيكيا مرتين بسرعة 6.0 لمدة 30 ثانية في كل مرة مع فترة راحة لمدة دقيقتين على الجليد بين كل تمزيق. ثم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام حمض الجواد ديوم ثيوسيانات فينيل كلوروفورم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

لتحليل OTCs عن طريق قياس التدفق الخلوي ، قم بإزالة الغشاء وفصل السقالة عن جل mtech الليفي الفيبرين. ثم أخيرا ، قم بقص الجل بمشرط كما هو موضح للتو. انقل الأنسجة إلى أنبوب فاكس.

الاستمرار في ملليلترين من عجينة الكولاجيناز. ثم ضع الأنبوب في 37 درجة مئوية في حمام مائي مع التحريك المغناطيسي لمدة 20 دقيقة. تحريك الماصة مرة كل خمس دقائق عندما يتم هضم الأنسجة تماما.

قم بتصفية معلق الخلية الناتج من خلال مصفاة 70 ميكرومتر وقم بتلطيخ الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المناسبة كما هو موضح. يمكن التعرف على MTS من خلال تعبير الكيراتين 14 ، مما يجعلها تتميز بسهولة عن الخلايا الليفية الإيجابية من المنتون. ومن المثير للاهتمام أن M Texs غير الناضجة والناضجة تظهر أنماط نمو مختلفة ولكنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة في الثقافة.

سبيل المثال ، عادة ما تشكل الطبقة الثنائية غير الناضجة CD 80 D low M Texs على اتصال وثيق بالخلايا الليفية. في حين أن CD 80 D high MTS تميل إلى تكوين مجاميع خلوية مدمجة محددة بواسطة الخلايا الليفية ، فإن المجموعات الفرعية mtech لا تعيش فحسب ، بل تتكاثر في ظل ظروف OTC ثلاثية الأبعاد كما يتضح من دمجها EDU. ومن المثير للاهتمام ، أن تقنيات CD 80 منخفضة MT تتكاثر بمعدل أعلى في وجود رانكل.

في حين أن العكس صحيح بالنسبة لتقنيات القرص المضغوط 80 عالية MT ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ثقافة MT. التقنيات التي تستخدم 3D OTCs. هذه طريقة أفضل بكثير من استخدام أنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد من حيث التمايز التقني وصيانة PGE والحث مع إمكانية دراسة أو معالجة العديد من معلمات الأخذ.