التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير ديناميكيات إصلاح الأنسجة باستخدام مجهر ستيريو عن طريق التصوير الزمني المسرع (time-lapse imaging). ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تربية أجنة سمك الزيبرا حتى تصل إلى المراحل اليرقية، حيث تكون الزعنفة الذيلية قد تطورت بشكل كافٍ لتصل إلى حجم يسمح بإجراء عمليات بتر بسهولة. وعادة ما يتم تحقيق ذلك بعد الفقس.

تتمثل الخطوة الثانية في بتر الزعنفة الذيلية باستخدام إبرة حقنة. والخطوة الثالثة هي وضع اليرقات في غرفة تصوير والتقاط فيلم بتصوير زمني سريع (time-lapse) باستخدام مجهر ستيريو. والخطوة النهائية هي قياس تجدد الزعنفة الذيلية كمياً باستخدام برنامج تحليل الصور مثل Bit Plains S أو البرنامج مفتوح المصدر image J. مرحباً. يدرس مختبري إصلاح الجروح وتجديد الأنسجة باستخدام سمكة الزيبرا كنموذج.

سنقوم اليوم بشرح طريقة لرصد ديناميكيات هذه العمليات في الوقت الفعلي باستخدام المجهر الستيريو ذي الحقل المضيء. سنستعرض اليوم طريقة ترصد العمليات المبكرة لتجديد الأنسجة باستخدام زعنفة الذيل ليرقات سمك الزيبرا. وتوفر طريقة التصوير المعروضة فرصة لمراقبة وتحليل السلوكيات على نطاق النسيج الكامل في إعداد مجهري بسيط، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع أي مجهر ستيريو مجهز بقدرات التصوير المتقطع (time-lapse).

دعونا نبدأ. تربية سمك الزيبرا حتى المراحل اليرقية. يمكن ملاحظة إصلاح الجروح في الزعنفة الذيلية بشكل أفضل بعد مراحل الفقس، حيث تكون الزعنفة الذيلية قد تطورت بشكل كافٍ بحلول هذا الوقت، ويمكن إجراء عمليات البتر بسهولة دون إتلاف الحبل الشوكي أو الأنسجة الأخرى.

اجمع البيض في مكان قريب، ثم قم بتحضينه في حاضنة عند درجة حرارة 28 degree Celsius طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، أزل الأجنة الميتة واغسلها بوسط جنيني يحتوي على محلول ملحي لأحواض السمك (instant ocean aquarium salt) بتركيز 0.03%. وإذا لزم الأمر، أضف وسطاً جنينياً يحتوي على pheno thyroid بتركيز 0.003% إلى الطبق لمنع تصبغ اليرقات.

في هذا العرض التوضيحي، نترك الأجنة لتنمو حتى يومين بعد الإخصاب في الحاضنة حتى تفقس اليرقات من بيوضها قبل تحضير غرفة التصوير. في هذه الخطوة، نقدم طريقتين لإنشاء غرفة التصوير. تتكون الطريقة الأولى من غرفة تصوير مصنوعة من أنابيب PVC أو تيفلون مخصصة لمياه الشرب، والتي يمكن الحصول عليها من أي متجر للمعدات.

استخدم أنابيب بقطر خارجي 25 millimeter وقطر داخلي 20 millimeter، حيث إن هذا الحجم هو المناسب لتثبيت غطاء الشريحة. قص الأنابيب لصنع حلقات بسمك 10 millimeter وبشكل متساوٍ قدر الإمكان. استخدم ورق الصنفرة لتنعيم الحواف، ثم اشطفها بالماء والإيثانول.

اترك الغرفة لتجف في الهواء. تتكون الطريقة الثانية إما من استخدام غرفة تصوير ذات قاعدة زجاجية بتقنية المطفأ (matte tech) وغطاء زجاجي مصنعة مسبقاً، أو صنع غرفة تصوير من طبق بتري صغير. لصنع غرفة التصوير الخاصة بك، استخدم طبق بتري بقطر 35 أو 50 مليمتر واثقب ثقباً بقطر 10 مليمتر في الغطاء.

بعد ذلك، يتم وضع شحم السيليكون على الجزء الخارجي من شريحة التغطية، ثم تُثبت شريحة تغطية مربعة أو مستديرة بمقاس 25 by 25 مليمتر على الجانب الخارجي باستخدام طرف ماصة نظيف لضمان بقاء مادة التثبيت متصلة بإحكام. وأثناء عملية التصوير، يتم تثبيت شبكة بلاستيكية دقيقة في الجزء الداخلي من شريحة التغطية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق قص الشبكة وفقاً لحجم قطر الحلقة الداخلية، ثم قص مستطيل صغير في منتصف الشبكة يكون حجمه حوالي ثلاثة أضعاف حجم اليرقات.

تثبيت وتصوير اليرقات قبل الإصابة. هذه الخطوة مناسبة للتقدير الكمي اللاحق لتجدد الزعنفة. أولاً، قم بتحضير محلول agar منخفض الانصهار بتركيز 0.5% في وسط جنيني لتثبيت العينة، مع نقل اليرقة المخدرة إلى محلول agar الذي تم الحفاظ عليه عند 42 درجة Celsius.

في كتلة تسخين، انقل اليرقات مع قطرة من agros إلى طبق بتري صغير وضع اليرقات على جانبها. باستخدام رأس تحميل ميكرو مغطى، اترك agros يتصلب ثم أضف محلول trica. انتقل إلى المجهر الستيريو الذي سيُستخدم لاحقاً.

بالنسبة للتصوير بنظام الفاصل الزمني (time-lapse imaging)، نستخدم مجهراً ستيريو من طراز zes discovery V 12 وبرنامج Axio vision لغرض العرض. أولاً، يتم ضبط إعدادات المجهر من خلال اختيار العدسة الشيئية والتكبير المناسبين للتصوير. بعد ذلك، يتم اختيار وضع الكشف بالكاميرا في المجهر عبر برنامج alvis.

اختر الوضع المباشر لعرض اليرقة على الشاشة. افتح نافذة الخصائص للكشف التلقائي عن السطوع، أو اضبط التباين يدويًا عند قاعدة الإضاءة النافذة للمجهر. حرك اليرقات خارج مجال الرؤية، ثم اختر ميزة تصحيح التظليل.

لتقليل الضوضاء الخلفية، أعد وضع اليرقات في مجال الرؤية والتقط صورة فورية. احفظ الصورة استعداداً لعملية الجرح. قم بإزالة اليرقات من الـ aros عن طريق كشط الـ aeros من الرأس أولاً.

يسمح هذا ليرقات السمك بالانزلاق من مادة الأجار عن طريق سحب الرأس برفق بعيداً عن مادة الأجار المتبقية. قم بتحضير طبق أجار بتركيز 1.5% باستخدام محلول ملح المحيط الفوري. وباستخدام مجهر ستيريو، ضع اليرقات جانبياً فوق مادة الأجار المتصلبة، ثم ابتر الجزء القاصي من زعنفة الذيل باستخدام إبرة حقنة قياس 23 gauge.

تثبيت اليرقات للتصوير بالفاصل الزمني. سنعرض طريقتين للتصوير بالفاصل الزمني. في الطريقة الأولى، سنوضح كيفية تصوير اليرقات في الحلقة الغرفية بعد تثبيت اليرقات.

قم بكشط مادة الأغار المتصلبة المحيطة بالزعنفة الذيلية القاصية بعناية باستخدام رأس ماصة تحميل دقيقة مغطى. يتيح ذلك التئام الجرح أو تجدد الأنسجة بشكل صحيح. حاول ألا تتسبب في إصابة الزعنفة بشكل متكرر دون تثبيت النسيج. خلال هذا الإجراء، قم بإزالة الحطام غير المرغوب فيه الذي يتداخل مع عملية التصوير من الحجرة عن طريق استبدال المحلول القديم.

باستخدام محلول Trica طازج، ضع شحم السيليكون على الجزء العلوي من الحجرة واملأ حلقة الحجرة بمحلول Trica طازج. ضع شريحة زجاجية في الأعلى لإحكام غلق الحجرة وفقاً للطريقة الثانية. في هذه الطريقة، سنوضح لك كيفية تصوير اليرقات في طبق بتري ذي غطاء زجاجي.

قم بتثبيت اليرقات على الغطاء، ثم ضع غطاء الشريحة واملأ الغطاء بمحلول trica. ثم اكشط الـ agros من الزعنفة الذيلية.

بعد ذلك، ضع الشحم السيليكوني على الحافة العلوية للغرفة السفلية واملأ الغرفة بمحلول trica. قم بتفريغ محلول trica من الغطاء بعناية، ثم اقلب الغطاء لغمر اليرقة في محلول trica الموجود في الغرفة السفلية، ويمكن القيام بذلك بزاوية مائلة قليلاً. ولتجنب تكون جيوب هوائية، سيتم إغلاق الغرفة باستخدام الشحم السيليكوني أثناء التصوير بالفاصل الزمني لضمان الحفاظ على درجة حرارة مناسبة تبلغ 28 degrees Celsius.

قم بتجهيز غرفة تحضين مسخنة مصنوعة من الورق المقوى وغلاف الفقاعات للعزل، واستخدم قبة سلكية مماثلة لتلك المستخدمة في تحضين بيض الدجاج كمصدر للحرارة. ضع غرفة التحضين حول المجهر واضبط درجة الحرارة على 28 درجة Celsius. ولمدة تتراوح بين 10 إلى 20 دقيقة تقريبًا أو حتى تستقر درجة الحرارة، افتح الجهة الأمامية لغرفة التحضين المسخنة وثبّت غرفة التصوير على المجهر.

ضع الشريحة بحيث تكون غطاء الشريحة متجهًا للأعلى نحو الشيئية. قم بوضعية زعنفة اليرقة بطريقة تترك ثلثي مجال الرؤية شاغرين لضمان رصد نمو وتجدد الزعنفة على مدار عملية التصوير. ودون الحاجة إلى إعادة تحديد موقع اليرقات في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد 60 بالبرنامج، اختر خيار Z stack والتصوير الزمني (time-lapse) في علامة تبويب Zack ووضع الشرائح (slice mode).

حدد سُمك الشريحة ثم اختر وضع البدء والتوقف. حدد الموضعين العلوي والسفلي للمجموعة في جدول التصوير المتقطع (time-lapse). حدد الفاصل الزمني ومدة المقطع المرئي، ثم اضغط على زر البدء لبدء التسجيل.

خلال الساعة الأولى، تحقق من حدود المحورين X وZ ليرقات الحشرات. وعند الضرورة، أعد تحديد موضع اليرقات بمرور الوقت لأنها قد تكون قد انزاحت نتيجة للنمو أو الاختلافات في تكوين مادة الـ agarose. احفظ الملف في نهاية تسجيل التصوير الزمني (time-lapse) ثم انتقل إلى خطوة المعالجة البعدية وتحليل بيانات القياس الكمي.

في هذا القسم، نناقش عدة طرق لتحليل البيانات الناتجة عن الطريقة الأولى باستخدام برنامج imas. أولاً، سنناقش كيفية تحديد نمو الزعنفة باستخدام برنامج imas. افتح فيلم التصوير الزمني (time-lapse) في برنامج Amaris واحفظ الملفات بتنسيق MRS.

لتحسين أداء البرنامج، اختر العرض المتعامد (orthogonal view) لعرض المقطع كإسقاط. ولقياس طول الزعنفة، اختر خيار إضافة نقاط قياس جديدة في شريط الأدوات العلوي الأيسر. وتحت قائمة تكوين قيم الإحصائيات المرئية، اختر قيم الإحصائيات التي سيتم عرضها في وضع الخط.

تحت علامة تبويب الإعدادات، اختر "pairs" في خصائص التسميات، ثم اختر "name" و "distance" لعرض المسافة بين النقطتين A و B بجانب خط القياس، وانتقل إلى وضع التحرير مع الضغط المستمر على مفتاح shift لتحديد النقطة الأولى عند الزعنفة القاصية. بعد ذلك، استخدم نفس التكوين لتحديد النقطة الثانية عند الطرف القاصي من الـ no accord. ستظهر المسافة في الصورة ويمكن تصديرها من علامة تبويب الإحصائيات.

من خلال تحديد زر القرص "تصدير الكل" (export all) الموجود في أسفل اليمين. وبديلاً عن خيار نقاط القياس، يمكن استخدام عارض الشرائح لقياس المسافات في وضع عرض الشريحة؛ قم بالتمرير إلى الموضع المطلوب وانقر على الموضعين الأول والثاني بزر الماوس الأيسر، وستظهر المسافة.

ومع ذلك، فإن هذا الخيار لا يسمح بتصدير البيانات. سنناقش الآن باختصار كيفية تحديد مساحة الزعنفة باستخدام برنامج Image J مفتوح المصدر. افتح فيلم TimeLapse في برنامج image J باستخدام إضافة تتعرف على تنسيق ملفات Zeiss Axio vision.

أو يمكن بدلاً من ذلك تحميل تسلسل صور TIFF غير مضغوط. سيضمن ذلك حفظ معلومات الملف تحت خيار analyze select set scale لتحديد المسافة والبكسلات والمسافة المعروفة، في حال لم تكن محفوظة في الملف. كما يجب ضبط وحدة الطول إلى micrometers.

في شريط الأدوات، اختر أداة التحديد الحر وقُم بتحديد محيط الجرح عبر الضغط المستمر على زر الفأرة الأيسر أثناء الرسم على طول حواف الجرح.

انقر على خيار القياس (measure) ضمن قائمة التحليل (analyze) لعرض النتائج التمثيلية لمساحة الجرح. يؤدي بتر الزعنفة إلى تجدد جزئي على مدار 36 ساعة تلي عملية البتر. وتظهر قياسات مساحة الزعنفة أن بتر الزعنفة يؤدي إلى انخفاض في أنسجة الزعنفة حتى حوالي 14 ساعة بعد البتر، ويفترض أن ذلك يعود إلى موت الخلايا، والذي يليه تجدد طولي رقيق.

تظهر المقارنة بين الزعنفة المبتورة والمتجددة زيادة بمقدار 2.48 ضعف في طول الزعنفة خلال 36 ساعة. يؤدي البتر في البداية إلى تحفيز تأثير "رباط السحب" (purse string effect) الذي يتميز بانقباضات عبر كابلات الأكتين والميوزين الموجودة في خلايا طية الزعنفة التي تبرز من جرح البتر ثم يتم التخلص منها لاحقاً. يزداد طول الجسم في البداية، ولكن الزعنفة لا تتجدد.

خلال المراحل المبكرة. وفي غضون 14 ساعة تقريبًا بعد البتر، تبدأ الزعنفة في النمو من المواقع القريبة إلى المواقع البعيدة. وباختصار، تظهر نتائجنا أن البتر يحفز انكماش الجرح، وهو الأمر الذي قد يكون ضروريًا لتعزيز بثق الخلايا.

بمجرد اكتمال العملية، تبدأ الزعنفة في التجدد، حيث يظهر نمو الزعنفة التطوري. وبمعزل عن هذه العملية، قمنا بتقديم طريقة تسمح بمراقبة العمليات الديناميكية لإصلاح الأنسجة باستخدام يرقات سمك الزيبرا الحية.

يتطلب هذا الإجراء جوانب معينة قمنا باختبارها من أجل تحسين النتيجة. وتتمثل الميزة الواضحة لطريقة التصوير المعروضة في أنها قابلة للتكيف بسهولة مع أي مجهر ستيريو مجهز بكاميرا CCD وبرنامج TimeLapse. كما أنها توفر بديلًا منخفض التكلفة لنظام التصوير البؤري (confocal) الأكثر تكلفة.

بينما لا تعتمد هذه الطريقة على الفلورة أو الكشف عن الخلايا، إلا أنه يمكن توسيع نطاقها لتشمل مثل هذه التطبيقات من خلال استخدام نظام مؤتمت للتحكم في التثبيت وبرمجيات إلغاء الالتفاف (deconvolution) بعد التصوير، وذلك لمراقبة عمليات إصلاح الجروح والتجدد بدقة دون خلوية. ويمكن لهذه الطريقة أن تزود الطلاب بفهم أفضل للعمليات البيولوجية الأساسية التي يقوم عليها إصلاح الأنسجة وتجددها. كما أن الوضوح البصري وسهولة استخدام أجنة ويرقات سمك الزيبرا (zebrafish) وقابلية النظام للتكيف مع أي مجهر ستيريو تجعل هذه الطريقة مناسبة لتدريس مبادئ بيولوجيا الفقاريات في البيئة الصفية.