التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

نقدم بروتوكولا لالتقاط ديناميكيات تجديد زعانف ذيل يرقات الزرد على نطاق كامل من الأنسجة باستخدام الفحص المجهري المجهري القائم على الحقل الساطع. تتيح هذه التقنية التقاط ديناميكيات التجديد بدقة خلية واحدة. يمكن تكييف هذه المنهجية مع أي مجهر مجسمة مزود بكاميرا CCD وبرنامج الفاصل الزمني.

يوضح هذا الفيديو طريقة لالتقاط ديناميكيات إصلاح الأنسجة على مجهر استريو باستخدام التصوير بفاصل زمني. يتم تحقيق ذلك عن طريق رفع أجنة الزرد أولا إلى مراحل اليرقات عندما تكون زعنفة الذيل قد تطورت بشكل كاف إلى حجم يمكن فيه إجراء البتر بسهولة. يتم تحقيق ذلك عادة بعد الفقس.

الخطوة الثانية هي بتر زعنفة الذيل باستخدام إبرة حقنة. الخطوة الثالثة هي تركيب اليرقات في غرفة التصوير والتقاط فيلم بفاصل زمني على مجهر استريو. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحديد تجديد زعانف الذيل باستخدام برنامج تحليل التصوير مثل Bit Plains S أو صورة البرنامج مفتوح المصدر J.Hi.My الدراسات المعملية لإصلاح الجروح وتجديد الأنسجة باستخدام أسماك الزرد كنموذج.

سنعرض اليوم طريقة تلتقط ديناميكيات هذه العمليات في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري الاستريو الساطع. سنعرض اليوم طريقة تلتقط العمليات المبكرة لتجديد الأنسجة باستخدام زعنفة ذيل يرقات الزرد. توفر طريقة التصوير المقدمة فرصة لمراقبة وتحليل سلوكيات مقياس الأنسجة بالكامل في إعداد مجهر بسيط ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع أي مجهر استريو مزود بقدرات الفاصل الزمني.

لذلك دعونا نبدأ. تربية الزرد إلى مراحل اليرقات. يمكن ملاحظة إصلاح الجرح في زعنفة الذيل بشكل أفضل بعد مراحل الفقس حيث أن زعنفة الذيل قد تطورت بشكل كاف بحلول هذا الوقت ، ويمكن إجراء عمليات البتر بسهولة دون الإضرار بالحبل الشوكي أو الأنسجة الأخرى.

على مقربة من ذلك ، اجمع البيض واحتضنه في حاضنة 28 درجة مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الأجنة الميتة واشطفها بوسط جنين يحتوي على 0.03٪ محلول ملح حوض السمك الفوري للمحيط. إذا لزم الأمر ، أضف وسط الجنين مع 0.003٪ من الغدة الدرقية الظاهرية إلى الطبق لمنع تصبغ اليرقات.

في هذا العرض التوضيحي ، تركنا الأجنة تتطور حتى يومين بعد الإخصاب في الحاضنة عندما تفقس اليرقات من تحضير كونس لغرفة التصوير. في هذه الخطوة ، نقدم طريقتين لبناء غرفة التصوير. تتكون الطريقة الأولى من غرفة تصوير مصنوعة من أنابيب PVC أو تفلون من درجة مياه الشرب ، والتي يمكن الحصول عليها في أي متجر لاجهزة الكمبيوتر.

استخدم الأنابيب ذات القطر الخارجي 25 ملم وقطر داخلي 20 ملم لأن هذا له الحجم المناسب لمرفق انزلاق الغطاء. اقطع الأنبوب لعمل حلقات بسمك 10 ملم قدر الإمكان. استخدم ورق الصنفرة لتنعيم الحواف وشطفها بالماء والإيثانول.

دع الغرفة تجف في الهواء. تتكون الطريقة الثانية إما من استخدام قاع زجاجي غير لامع مصنع مسبقا ، أو غرفة تصوير زجاجية علوية ، أو صنع غرفة تصوير من طبق بتري صغير. لإنشاء غرفة التصوير الخاصة بك ، استخدم طبق بتري 35 أو 50 ملم وحفر ثقب 10 ملم في الغطاء.

بعد ذلك، يضع شحم السيليكون على الجزء الخارجي من زلة الغطاء ويرفق زلة غطاء مربعة أو دائرية مقاس 25 × 25 ملم إلى الخارج بطرف ماصة نظيف لضمان بقاء الغطاء الزراعي المثبت مثبتا بإحكام. أثناء إجراء التصوير، قم بتوصيل شبكة بلاستيكية دقيقة بالجزء الداخلي من زلة الغطاء. يمكن تحقيق ذلك عن طريق قطع الشبكة بحجم قطر الحلقة الداخلية ثم قطع مستطيل صغير حوالي ثلاثة أضعاف حجم اليرقات في منتصف الشبكة.

تركيب وتصوير يرقات ما قبل الإصابة. هذه الخطوة مناسبة للقياس الكمي لاحقا لتجديد الزعانف. أولا ، قم بإعداد محلول زراعي منخفض الذوبان بنسبة 0.5٪ في وسط الجنين لتثبيت العينة التي تنقل اليرقة المخدرة إلى محلول aro الذي تم الحفاظ عليه عند 42 درجة مئوية.

في كتلة تسخين ، انقل اليرقات بقطرة من agros إلى طبق بتري صغير وضع اليرقات على جانبها. باستخدام طرف محمل صغير مغطى ، اسمح للقوارب بالتصلب وإضافة محلول trica. انتقل إلى المجهر الاستريو الذي سيتم استخدامه لاحقا.

للتصوير بفاصل زمني ، نستخدم مجهر استريو zes discovery V 12 وبرنامج رؤية Axio للتوضيح. أولا ، اضبط إعدادات المجهر عن طريق تحديد الهدف والتكبير المناسبين للتصوير. ثم حدد وضع الكشف عن الكاميرا على المجهر في برنامج alvis.

حدد الوضع المباشر لعرض اليرقة على الشاشة. افتح نافذة الخصائص لاكتشاف السطوع تلقائيا ، وضبط التباين يدويا في قاعدة إضاءة المجهر. حرك اليرقات خارج مجال الرؤية وحدد ميزة تصحيح التظليل.

لتقليل ضوضاء الخلفية ، ضع اليرقات مرة أخرى في مجال الرؤية والتقط لقطة. احفظ الصورة للتحضير للجرح. قم بإزالة اليرقات من الآروس عن طريق كشط الأيروس أولا عن الرأس.

هذا يسمح لليرقات بأن تكون قادرة على الانزلاق من الأيروس عن طريق سحب الرأس برفق بعيدا عن مقايسة البتر المتبقية. قم بإعداد طبق 1.5٪ aeros باستخدام محلول ملح المحيط الفوري. تحت مجهر استريو ، ضع اليرقات جانبا على القوس المتصلب وبتر الجزء البعيد من زعنفة الذيل بإبرة حقنة قياس 23.

تركيب اليرقات للتصوير بفاصل زمني. سوف نقدم طريقتين للتصوير بفاصل زمني. في الطريقة الأولى ، سنوضح كيفية تصوير اليرقات في حلقة الغرفة بعد تركيب اليرقات.

اكشط بعناية الأغروس الصلبة المحيطة بزعنفة الذيل البعيدة بطرف ماصة محمل صغير مغطى. هذا يسمح بالتئام الجروح بشكل صحيح أو تجديد الأنسجة دون تقييد الأنسجة ، حاول ألا تصيب الزعنفة بشكل متكرر. أثناء هذا الإجراء ، قم بإزالة الحطام غير المرغوب فيه الذي يتداخل مع إجراء التصوير من الغرفة عن طريق استبدال المحلول القديم.

باستخدام محلول Trica الطازج ، ضع شحم السيليكون على الجزء العلوي من الحجرة واملأ حلقة الحجرة بمحلول trica جديد. ضع شريحة زجاجية على الأعلى لإغلاق طريقة الغرفة الثانية. في هذه الطريقة ، سنوضح لك كيفية تصوير اليرقات في طبق بتري زجاجي.

قم بتركيب اليرقات على الغطاء ، وقم بتغطية الانزلاق واملأ الغطاء. مع حل trica. اكشط agros من زعنفة الذيل.

بعد ذلك ، ضع شحم السيليكون على الحافة العلوية للغرفة السفلية واملأ الغرفة بمحلول trica. صب محلول trica بعناية من الغطاء واقلب الغطاء لغمر اليرقة في محلول trica في الغرفة السفلية ، والتي يمكن القيام بها بزاوية طفيفة. لتجنب الجيوب الهوائية ، سيتم إغلاق الغرفة بتصوير الشحوم السيليكون بفاصل زمني لضمان الحفاظ على درجة حرارة مناسبة تبلغ 28 درجة مئوية.

قم بتجميع غرفة حضانة ساخنة مصنوعة من غلاف فقاعات من الورق المقوى للعزل وقبة سلكية كما تستخدم في حضانة بيض الدجاج كمصدر للحرارة. ضع حجرة الحضانة حول المجهر واضبط درجة الحرارة على 28 درجة مئوية. لمدة 10 إلى 20 دقيقة أو حتى تستقر درجة الحرارة ، افتح الجزء الأمامي من غرفة الحضانة المدفأة وضع غرفة التصوير على المجهر.

قف مع انزلاق الغطاء متجها لأعلى نحو الهدف. ضع زعنفة اليرقات بطريقة يظل فيها ثلثا مجال الرؤية غير مأهول لضمان التقاط نمو الزعنفة وتجديدها على مدار إجراء التصوير. دون الحاجة إلى إعادة وضع اليرقات في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد 60 للبرنامج ، حدد مكدس Z وخيار الفاصل الزمني في علامة التبويب Zack ووضع الشريحة.

حدد سمك الشريحة ثم حدد وضع إيقاف البدء. حدد المواضع العلوية والسفلية للمكدس في جدول اللقطات المتتابعة. حدد الفاصل الزمني ومدة الفيلم، ثم اضغط على زر البدء لبدء التسجيل.

في غضون الساعة الأولى ، تحقق من حدود زاك لليرقات. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير وضع اليرقات بمرور الوقت لأنها قد تكون قد تحولت بسبب النمو أو الاختلافات في تكوين agros. احفظ الملف في نهاية التسجيل بفاصل زمني وتابع تحليل بيانات خطوة المعالجة اللاحقة والقياس الكمي.

في هذا القسم ، نناقش عدة طرق لتحليل طريقة البيانات التي تم إنشاؤها في وضع IMAS. أولا ، سنناقش كيفية تحديد نمو الزعانف باستخدام برنامج imas. افتح فيلم الفاصل الزمني في برنامج Amaris واحفظ الملفات بتنسيق ملف MRS.

لتحسين أداء البرنامج، حدد طريقة العرض المتعامدة لعرض الفيلم كعرض. لقياس طول الزعنفة، حدد خيار إضافة نقاط قياس جديدة في شريط الأدوات العلوي الأيسر. ضمن تكوين قائمة قيمة الإحصائيات المرئية، حدد قيم الإحصائيات التي سيتم عرضها في وضع الخط.

ضمن علامة تبويب الإعدادات، حدد الأزواج في خصائص التسميات، وحدد الاسم والمسافة لعرض المسافة بين النقطتين A وB بجوار خط القياس، وقم بالتبديل إلى وضع التحرير واضغط باستمرار على زر shift لتحديد النقطة الأولى عند الزعنفة البعيدة. ثم استخدم نفس التكوين لتحديد النقطة الثانية في الطرف البعيد من عدم الاتفاق. سيتم عرض المسافة في الصورة ويمكن تصديرها ضمن علامة التبويب الإحصائيات.

عن طريق تحديد زر القرص ، قم بتصدير الكل في أسفل اليمين. بدلا من خيار نقاط القياس ، يمكن استخدام عارض الشرائح لقياس المسافات في وضع عرض الشرائح. قم بالتمرير إلى الموضع المطلوب وانقر على الموضعين الأول والثاني باستخدام زر الماوس الأيسر ، وسيتم عرض المسافة.

ومع ذلك ، لا يسمح هذا الخيار بتصدير البيانات. سنناقش الآن بإيجاز كيفية تحديد منطقة الزعنفة باستخدام البرنامج مفتوح المصدر. الصورة J.افتح فيلم TimeLapse في الصورة J باستخدام مكون إضافي يتعرف على تنسيق ملف رؤية Zeiss Axio.

بدلا من ذلك، قم بالتحميل في تسلسل TIFF غير مضغوط. سيضمن ذلك حفظ معلومات الملف ضمن تحليل تحديد مقياس لتحديد المسافة والبكسل والمسافة المعروفة ، إذا لم يتم الاحتفاظ بها في الملف. أيضا ، اضبط طول الوحدة على ميكرومتر.

في شريط الأدوات. حدد أداة تحديد اليد الحرة وحدد الجرح بالضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر. أثناء الرسم على طول حواف الجرح.

انقر فوق خيار القياس ضمن التحليل لعرض منطقة النتائج التمثيلية للجرح. يؤدي بتر الزعنفة إلى تجديد جزئي على مدار 36 ساعة بعد البتر. تظهر قياسات منطقة الزعنفة أن بتر الزعانف يؤدي إلى انخفاض في أنسجة الزعانف حتى حوالي 14 ساعة بعد البتر ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب موت الخلايا ، والذي يتبعه طول تجديد رقيق.

تظهر مقارنة الزعنفة المبتورة والمتجددة زيادة بمقدار 2.48 ضعفا في طول الزعنفة في غضون 36 ساعة. يؤدي البتر في البداية إلى تأثير سلسلة المحفظة الذي يتميز بالتقلصات عبر كابلات الأكتين ميوسين الموجودة في خلايا طيات الزعنفة التي تنبثق من جرح البتر ويتم إزالتها لاحقا. يزداد طول الجسم في البداية ، لكن الزعنفة لا تتجدد.

خلال المراحل المبكرة. بعد حوالي 14 ساعة من البتر ، تبدأ الزعنفة في النمو من المواضع القريبة إلى البعيدة. باختصار ، توضح نتائجنا أن البتر يؤدي إلى تقلص الجرح ، والذي قد يكون ضروريا لتعزيز بثق الخلايا.

بمجرد اكتمال العملية ، تبدأ الزعنفة في التجدد. يبدو أن نمو الزعنفة التنموية يحدث. بغض النظر عن هذه العملية ، قدمنا طريقة تسمح بمراقبة العمليات الديناميكية لإصلاح الأنسجة باستخدام يرقات الزرد الحية.

يتطلب هذا الإجراء جوانب معينة اختبرناها من أجل تحسين النتيجة. تتمثل الميزة الواضحة لطريقة التصوير المعروضة في أنها قابلة للتكيف بسهولة مع أي مجهر استريو مزود بكاميرا CCD وبرنامج TimeLapse. كما أنه يوفر بديلا منخفض التكلفة لنظام التصوير متحد البؤر الأكثر تكلفة.

على الرغم من أن هذه الطريقة لا تستخدم التألق أو الكشف عن الخلايا ، إلا أنه يمكن توسيعها لمثل هذه التطبيقات من خلال استخدام نظام آلي للتحكم في التحطم وبرنامج إزالة الالتواء بعد التصوير لمزيد من المراقبة لعمليات إصلاح الجروح وتجديدها بدقة تحت الخلوية. يمكن أن تزود هذه الطريقة الطلاب بفهم أفضل للعمليات البيولوجية الأساسية وإصلاح الأنسجة الأساسية وتجديدها. إن الوضوح البصري والسهولة التي يمكن بها استخدام الزرد الجنيني واليرقي وقدرة النظام على التكيف مع أي مجهر استريو يجعله مناسبا لتدريس بيولوجيا الفقرات الأساسية في الفصل الدراسي.