التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الكالسيوم أو أكسيد النيتريك في وعاء دموي تم عزله حديثاً باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال العزل الميكانيكي للوعاء وتحضيره. بعد ذلك، يتم تحضين الوعاء في صبغة وسم الكالسيوم أو صبغة وسم O مع حمض onic.

بعد ذلك، يتم تثبيت الوعاء في طبق مغطى بالسيليكون باستخدام شبكة ودبابيس لتوفير رؤية مستقرة أثناء التصوير ثنائي الفوتون. وأخيراً، يتم إجراء التصوير ثنائي الفوتون وقياس النتائج كمياً. يوضح هذا الفيديو ارتفاع إشارات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا البطانية للأوعية الدموية المعزولة استجابةً للتغيرات في تركيز الكالسيوم خارج الخلية.

في نهاية المطاف، ستسمح هذه الطريقة للباحثين بمراقبة تغيرات الكالسيوم أو أكسيد النيتريك في الخلايا البطانية أو خلايا العضلات الملساء في وعاء دموي معزول حديثاً. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في قدرتها على توفير دقة إشارة أفضل وقياسات دقيقة للعمليات داخل الخلايا في الأنسجة الوعائية. وهنا، تم تطبيق هذه التكنولوجيا بالاقتران مع النرد الكلاسيكي، وليس الهندسي، لقياس عابر الكالسيوم وإنتاج أكسيد النيتريك في خلايا فردية على أوركا مجوفة معزولة.

نعتقد أن هذه التقنية ستسهم في تطوير معرفتنا بالآلية المنظمة لمستويات الكالسيوم والأكسيد داخل الخلايا في الأنواع المختلفة من الخلايا الوعائية. يوفر التصوير بالمجهر المعتمد على إثارة الفوتونين للخلايا الحية، خاصة في الأنسجة السليمة مثل الأوعية الدموية، مزايا تتمثل في دقة الإشارة العالية وانخفاض تألق الخلفية خارج نطاق التركيز. كما أن التمركز الضيق لإثارة الفوتونين يعمل على إضاءة حجم بؤري واحد في النسيج، مما يقلل بشكل كبير من الامتصاص خارج نطاق التركيز ويخفض تشتت الضوء، وهو ما يسمح لنا بتصوير ديناميكيات الفلوروفور في الأنسجة ذات التألق الذاتي العالي التي تحتوي على ألياف الكولاجين والإيلاستين.

بعد عزل الأبهر لدى الجرذ، وفقاً للبروتوكول النصي تحت مجهر تشريحي، استخدم ملقطاً دقيق الطرف ومقصات مجهرية لتشريح الدهون والأنسجة الضامة من الأبهر. وبمجرد تنظيفه، اقطع العضو طولياً وانقله إلى محلول ملحي فسيولوجي لاستخدامه لاحقاً. ولتحضير كوكتيل التحميل، أضف 7 µL من صبغة flu oh 4:00 AM الجاهزة بتركيز 1 mM ومحلول DMSO إلى 450 µL من محلول PSS الخالي من الكالسيوم.

ثم أضف 40 µL من محلول حمض الأونيك بتركيز 10% غير القائم على DMSO إلى كوكتيل التحميل للمساعدة في تشتيت استرات أسيتيل الميثيل وتحسين تحميل صبغة الكالسيوم. ضع الشرايين الأورطية المستأصلة في أنابيب سعة 500 µL تحتوي على كوكتيل التحميل. غطِ الأنابيب بورق الألمنيوم وضعها على هزاز دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد اتباع البروتوكول النصي لتثبيت نسيج الأبهر على سطح طبق مطلي بالسيليكون، ضع الطبق أسفل قطعة الأنف في مجهر فوتوني ثنائي قائم، وقم بتركيب وتوجيه عدسة شيئية غمر مائي 25 x فوق العينة، ثم ثبّت مرشح انبعاث مطابق في منفذ المجهر. وباستخدام البرنامج، قم بتفعيل ليزر الأشعة تحت الحمراء الفوتوني الثنائي واضبط استثارة الليزر على 820 نانومتر تحت الضوء النافذ. وباستخدام الضبط الخشن للعدسة الشيئية، حدد موقع الأبهر وقم بتركيز العدسة الشيئية على السطح البطاني.

قم بتحويل المجهر إلى وضع المسح الليزري ثنائي الفوتون، مع التأكد من أن ليزر الإثارة في وضع القفل النمطي (mode locked). يتم تفعيل الكواشف الممسوحة غير المعتمدة على التمييز الطيفي (non DS) بقدرة ليزر تتراوح بين 5 إلى 10% تقريبًا. ابدأ عملية المسح المباشر.

وأخيرًا، اضبط العدسة الشيئية لجعل الخلايا البطانية أو خلايا العضلات الملساء في بؤرة التركيز. قم بجمع صور متسلسلة وفقًا لنص البروتوكول التجريبي. احفظ الصور بتنسيق يتضمن البيانات الوصفية لإجراء معالجة الصور والحسابات؛ قم بتنزيل وتثبيت حزمة Fiji لمعالجة الصور، والتي تم إصدارها بموجب الرخصة العامة.

باستخدام البرنامج، افتح ملف صورة. ثم عند الظهور، قم بفصل قنوات الضوء النافذ والقنوات الفلورية لاستخدام القنوات الفلورية فقط لتحليل البيانات داخل برنامج Fiji. انقر فوق علامة تبويب التحليل (analyze) وقم بالتمرير لأسفل حتى خيار الأدوات (tools).

بعد ذلك، انقر فوق علامة تبويب مدير منطقة الاهتمام (ROI manager)، وستظهر نافذة جديدة. بعد ذلك، وتحت علامة تبويب التحليل (analyze)، انقر فوق تعيين القياسات (set measurements) وحدد القياسات المحددة ذات الصلة. وذلك لقياسات عابر الكالسيوم.

استخدم خيار قيمة الرمادي المتوسطة (mean gray value). ثم باستخدام أداة التتبع الدائري، ابدأ بتتبع المناطق المستهدفة، وانقر على "إضافة" (add) في مدير مناطق الاهتمام (ROI manager) لكل منطقة يتم اختيارها. وبمجرد تتبع جميع الخلايا المستهدفة، اختر "قياس متعدد" (multi mesure) من علامة التبويب "المزيد" (more) في مدير مناطق الاهتمام.

وأخيراً، قم بحفظ القياسات مباشرة أو انسخها والصقها في جدول بيانات وأجرِ الحسابات وفقاً للبروتوكول النصي. وباستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو، يسهل تحديد موقع الخلايا البطانية في الشريان الأورطي نظراً لشكلها وإشارتها الفلورية القوية. ستكون خلايا العضلات الملساء مرئية أيضاً في نفس المجال مع الخلايا البطانية، مما سيؤدي إلى فهم أفضل لكيفية استجابة هذين النوعين من الخلايا بشكل مشترك ومستقل في آن واحد لمختلف المواد المُنَشطة والمحفزات، وهو ما يثبت فائدة هذه الطريقة.

تم تحديد قياسات الاستجابة للأستيل كولين أو CHA، وهو موسع وعائي يعتمد على الكالسيوم ومؤثر قوي على البطانة، كما هو موضح هنا؛ فبعد إضافة CHA، يزداد تألق الخلايا البطانية مقارنة بالخلايا الموجودة في PSS وحده، مما يشير إلى زيادة سريعة في محتوى الكالسيوم داخل الخلايا والتي تعود ببطء إلى المستوى الأساسي. يعد هذا البروتوكول مناسباً أيضاً للكشف عن إنتاج أكسيد النيتريك في البطانة. في هذه التجربة، تم تحميل الخلايا البطانية للشريان الأورطي بـ DAF FM D acetate.

زاد إنتاج صبغة ENO بطريقة تعتمد على الكالسيوم استجابةً لتحفيز CH، وقد تم تثبيط هذه الاستجابة باستخدام مثبط سينثيز OCH البطاني L name. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال فيزيولوجيا القلب والأوعية الدموية. إن استخدام الإجراء التجريبي الموصوف هنا، جنباً إلى جنب مع العديد من نماذج الحيوانات المعدلة وراثياً المتاحة، يوفر آفاقاً جديدة لتطبيق FAR FSA للمجهر الضوئي الثنائي في الأبحاث الأساسية والترجمية.

قد يمنحك استخدام هذا النهج فهماً متعمقاً ورؤية ميكانيكية لمسارات إشارات خلوية محددة داخل خلايا الأوعية الدموية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ستتعلم كيفية تطبيق هذه التقنية للمراقبة في الوقت الفعلي لمستويات الكالسيوم وأكسيد النيتريك داخل الخلايا الفردية للأوعية الدموية المعزولة حديثاً.