دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

الهدف العام من الإجراء التالي هو توسيع الخلايا الجذعية السرطانية في المختبر باستخدام تقنية مزرعة أنكوراج المستقلة ، ثم اختبار التأثيرات الأيضية للعلاجات الجديدة التي تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق فصل عينة من أنسجة سرطان البنكرياس البشري أولا في معلق خلية واحدة. في الخطوة الثانية ، يتم هضم أنسجة الورم بالإنزيمات ثم زرعها على صفيحة الجيلاتين لإزالة مجموعة خلايا الخلايا الليفية ، يتم بعد ذلك زرع الخلايا السرطانية المعزولة في صفيحة متعددة الآبار منخفضة للغاية ، ومعالجتها بالدواء المعني لتقييم النشاط الأيضي وتشكيل مجالات الورم.

في النهاية ، يمكن استخدام الدواء المعني في الفئران المعرضة للخطر في المناعة التي تحمل طعوم غريبة مشتقة من المريض للتحقق من آثار الدواء في الجسم الحي. هذه الطريقة هي أداة قوية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية وتعمل كخطوة أولى لتطوير علاجات جديدة تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية. سأعرض الإجراء أنا ، باحث مبتدئ في مركز الخلايا الجذعية في السرطان والشيخوخة في معهد سرطان الثدي وتيني كروز ، طالبة دكتوراه من مختبري لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من سرطان الغدي الأقنية في خزانة السلامة الحيوية المعقمة.

استخدم مشرطا معقما وملقطا لفرم الورم البشري في طبق استزراع 60 × 15 ملم يحتوي على ملليلتر واحد من PBS المعقم ، مع إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر أخرى من PBS حسب الضرورة حتى يتم فصل الأنسجة تماما. انقل تعليق الأنسجة إلى أنبوب مخروطي معقم وأضف PBS إلى الحجم النهائي البالغ خمسة ملليلتر. ثم قم بتجانس العينة ميكانيكيا باستخدام جهاز طرد مركزي للتفكك وهضم الأنسجة المتجانسة بالكولاجيناز عند 37 درجة مئوية.

بعد ساعة من أجهزة الطرد المركزي ، تقوم الخلايا بإعادة تشكيل الحبيبات ، وتعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسط الكامل. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى. هذه المرة, إعادة التشكيل تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من CK بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة, إزالة المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في وسط الخلايا الجذعية السرطانية.

ثم احتضان الخلايا على طبق مغطى بالجيلاتين عند 37 درجة مئوية لإزالة معظم خلايا الخلايا الليفية سريعة الارتباط. بعد ساعة واحدة ، استرجع المادة الطافية وحدد عدد خلايا سرطان البنكرياس القابلة للحياة لتسهيل تكوين مجال الورم للسرطان. يعمل تخصيب الخلايا الجذعية على تخفيف الخلايا بالحجم المناسب من وسط الخلايا الجذعية السرطانية إلى تركيز نهائي مرتين في 10 إلى الخلايا الثلاث لكل مليلتر ، وتبريدها على الجليد لبضع دقائق.

ثم بعد إضافة 500 ميكرولتر من PBS إلى الصفين الأول والأخير من 24 لوحة خلية منخفضة للغاية ، أعد تعليق الخلايا بواسطة الماصة وبذرة مليلتر واحد من الخلايا لكل بئر في الآبار الفارغة للوحة. يعالج أربعة آبار الخلايا مع المخدرات من فائدة وعلى الأقل أربعة سلبية تحكم آبار مع مركبة. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد.

كل يومين ، أضف علاجا جديدا لسيارتنا إلى كل بئر. في اليوم الخامس أو السابع ، قم بتقييم عدد مجالات الورم المشكلة باستخدام عداد خلوي آلي يسمح بتحديد الهياكل الأكبر للتغليف التسلسلي لمجالات الورم. في اليوم السابع ، استخدم مصفاة خلوية 40 ميكرومتر لحصاد الكرات.

بعد ذلك ، قم بتدوير الكرات واحتضانها في مليلتر واحد من التربسين لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لفصل الحبيبات في معلق خلية واحدة. ثم قم بتوسيع الخلايا لمدة سبعة أيام أخرى كما هو موضح للتو لإعداد المجالات لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية أو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بعد التفكك كما هو موضح للتو ، قم بتدوير الكرات وإعادة تعليق الحبيبات في HBSS التي تحتوي على المسبار المناسب. بعد حضانة لمدة 20 دقيقة في الظلام عند 37 درجة مئوية ، ضع الخلايا على الجليد حتى التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي لإعداد الكرات لقياس استهلاكها للأكسجين.

قم أولا بتغطية لوحة ثقافة الخلايا 96 بئر بمادة لاصقة للخلايا والأنسجة لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بفصل المجالات والتربسين كما هو موضح. ثم اغسل اللوحة مرتين إلى ثلاث مرات بالماء لإزالة الصفيحة اللاصقة الزائدة ، الخلايا المفردة في ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.

في 150 ميكرولتر من وسط فحص استهلاك الأكسجين الذي يحتوي على الجلوكوز وبيروفات الصوديوم يلتصق بالخلايا في قاع الآبار عن طريق الطرد المركزي حتى يتم الوصول إلى 100 مرة G. ترك جهاز الطرد المركزي يتوقف مع الانقطاع. ثم عكس اتجاه اللوحة وكرر الدوران.

الآن احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. وفي الوقت نفسه ، قم بتحميل واردات خرطوشة الفحص. A و B و C. حقن 25 ميكرولترا من تركيز ثلاثة وستة وتسعة ملليمولار من الدواء محل الاهتمام على التوالي ، واستورد D عند 25 ميكرولترا من تركيز ميكرومولار واحد من مثبط الميتوكوندريا.

عندما تكون الخلايا جاهزة ، قم بمعايرة الخرطوشة وتحميل لوحة ثقافة الخلية. أخيرا ، قم بإجراء الاختبار باستخدام البروتوكول القياسي للخلط والقياس في هذه التجارب التمثيلية ، أدى علاج الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس بالميتفورمين إلى تقليل حجم وعدد مجالات الورم بشدة. علاوة على ذلك ، تم عرض هذه التخفيضات من خلال ثقافات المجال الثانوية والثالثية.

حتى عندما تم التعامل مع ثقافة المجال الأولية فقط بالميتفورمين ، ورد أن الميتفورمين يعمل كمثبط للميتوكوندريا. في الواقع ، في هذه التجربة ، لوحظ أن الدواء يحفز انخفاضا سريعا ومعتمدا على الجرعة في استهلاك الأكسجين في الخلايا السرطانية الذي يرتبط بقدرته على تحفيز إنتاج ROS. الأهم من ذلك ، أن الفئران المعالجة بالميتفورمين تظهر انخفاضا قصير المدى ولكنه كبير في تطور سرطان البنكرياس الغدي مقارنة بحيوانات التحكم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل الأورام البشرية الجديدة. عزل الخلايا السرطانية الأولية ، وإعدادها كثقافة تكوين المجال ، وتقييم النشاط الأيضي للخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس.