التغليف حرارة Preadipocytes للزراعة إلى الدهنية مستودعات الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح عملية تغليف خط خلوي تقويضي مولد للحرارة وتطبيقاته في المختبر، ومن المحتمل في الكائن الحي. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير معلق خلوي من ألجينات الصوديوم وانقله إلى حقنة سعة خمسة ملليلتر. الخطوة التالية هي استخدام جهاز تغليف لإنتاج حبيبات الألجينات الدقيقة.

يتم بعد ذلك تغليف الخرزات الدقيقة بمحلول poly L lysine متعدد الأيونات، ثم تُزال نواة الألجينات لاحقاً لتكوين غشاء شبه نفاذ حول معلق خلوي. وتتمثل الخطوة النهائية في استنبات الخلايا المغلفة استنباتاً مشتركاً مع خطوط خلوية أخرى أو حقنها في الأنسجة الدهنية للفئران. وفي النهاية، يُظهر تحليل الدم المناعي نشاطاً تحللياً للدهون أعلى في الخلايا الدهنية المستنبتة استنباتاً مشتركاً مع aldehyde dehydrogenase، وهي كبسولات دقيقة تحتوي على خلايا دهنية تعاني من نقص في هذا الإنزيم.

بينما يظهر الكيمياء النسيجية المناعية نجاح عملية زرع الخلايا المغلفة في الأنسجة الدهنية للفئران، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول عملية التوليد الحراري والأنسجة الدهنية البنية. كما يمكن تطبيقها على نماذج حيوانية أخرى موجودة لتوفير نظام نموذج تجريبي منخفض التكلفة لاختبار المجموعات الفرعية من الخلايا داخل الجسم الحي. ومن أجل الاكتشافات الطبية الحيوية، يجب تنفيذ جميع الإجراءات داخل كابينة سلامة بيولوجية من المستوى الثاني ذات تدفق صفائحي.

للبدء، قم بإزالة الوسط القديم من قارورة زراعة الخلايا واشطف الخلايا前-الدهنية (preadipocytes) بـ 10 milliliters من PBS. قم بإزالة PBS وأعد تعليق الخلايا في 2 milliliters من 0.25%tripsin EDTA. خذ عينة حجمها 10 microliter من معلق الخلايا وقم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).

وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، أضف DMEM إلى الخلايا المتبقية للحصول على العدد المثالي من الخلايا، ثم قم بالطرد المركزي عند 480 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد تحديد كمية الخلايا المطلوبة باتباع الإرشادات الواردة في نص البروتوكول، نقوم بتعليق كتلة الخلايا في حجم مناسب من محلول ألجينات الصوديوم بتركيز 2%. ثم انقل محلول خلايا ألجينات الصوديوم إلى حقنة سعة خمسة ملليلتر.

قم بإزالة أي فقاعات هوائية من المحلول واقلب المحقنة لإنشاء جيب هوائي بحجم 1 milliliter. وللتحضير لعملية التغليف، ضع بيكر صغير يحتوي على 144 milliliters من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 100 millimolar. وتحت فوهة إبرة جهاز التغليف، قم بتثبيت القطب الكهربائي بالمواد المراد تغليفها بحيث يكون الطرف على ارتفاع 2.5 centimeters تقريباً فوق سطح محلول كلوريد الكالسيوم.

ضع المحقنة التي تحتوي على محلول خلايا ألجينات الصوديوم بإحكام في مضخة المحاقن. قم بتوصيل الأنبوب المطاطي بفتحة المحقنة. ادفع المكبس حتى يدخل محلول خلايا ألجينات الصوديوم إلى منتصف الأنبوب.

اضبط الجهد الكهربائي على 5.4 kilovolts واضبط القطر على 12.06 millimeters في مضخة الحقنة. اضبط السرعة على ثلاثة milliliters per hour. ابدأ تشغيل المضخة، ثم قم بتشغيل جهاز التغليف مع الحفاظ على الجهد عند 5.4 kilovolts.

أغلق نافذة غطاء التدفق الرقائقي وتجنب أي اهتزازات غير ضرورية حتى يكتمل تكوين الحبيبات الدقيقة الألجينية. بعد مرور كل المحلول عبر الإبرة، اترك الحبيبات الدقيقة الألجينية كروية الشكل لتتصلب في محلول كلوريد الكالسيوم لمدة 20 دقيقة إضافية قبل تغليفها بـ polyanionic polylysine أو PLL. وبمجرد تصلب الحبيبات الدقيقة كروية الشكل من ألجينات الصوديوم، أخرج البيكر الذي يحتوي على الحبيبات الدقيقة من جهاز التغليف.

انقل الخرزات الدقيقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter. قم بإزالة محلول كلوريد الكالسيوم من كتل الخرزات الدقيقة. اغسل الخرزات الدقيقة بإضافة 30 milliliters من محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9% ورج الأنبوب بلطف يدوياً.

اترك الحبيبات الدقيقة تترسب بفعل الجاذبية. بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 25 milliliter لإزالة محلول sodium chloride بهذه الطريقة. اغسل الحبيبات الدقيقة ثلاث مرات في المجمل.

بعد ذلك، أضف محلول PLL بتركيز 0.05% إلى الخرزات الدقيقة. استخدم 10 milliliters من محلول PLL لكل 1 milliliter من محلول ألجينات الصوديوم. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس بسرعة 1000 rotations per minute لمدة 10 minutes، وهي مدة كافية عادةً لعملية تغليف PLL.

بعد التأكد من تشكّل غلاف PLL، قم بإزالة محلول PLL واغسل الكبسولات ثلاث مرات بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9% كما هو موضح سابقاً؛ ولإزالة اللب البديل من الحبيبات الدقيقة المطلية بـ PLL أولاً، أضف 30 ملليلتر من محلول سترات الصوديوم بتركيز 50 ميليمولار إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. انتظر لمدة خمس دقائق أو حتى يذوب كل ألجينات الصوديوم. اغسل الكبسولات ثلاث مرات بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9% كما سبق توضيحه.

بعد الغسلة الثالثة بـ 20 milliliters من وسط الزرع، انقل جميع الكبسولات التي تحتوي على الخلايا إلى دورق زراعة الخلايا، ثم تعامل مع الخلايا المكبسلة وفقاً لظروف زراعة الخلايا القياسية. يجب زراعة الخلايا المضيفة لهذا الإجراء في أطباق ذات 24 بئراً حتى تصبح متلاحمة. استخدم وسط نمو الخلايا الليفية المُحضّر كما هو موضح في البروتوكول المرفق.

نص لاستزراع الخلايا前الشحمية. انقل الكبسولات الدقيقة إلى طبق بـ 24 بئراً يحتوي على خلايا مضيفة متلاصقة، وأضف الكبسولات الدقيقة لتحقيق طبقة أحادية في كل بئر، ثم حفز تمايز الخلايا前الشحمية باستخدام وسط التمايز الأول، واحضنها لمدة 48 ساعة.

بعد 48 ساعة، يتم تغيير الوسط إلى وسط التمايز الثاني (differentiation Medium Two)، ثم يُستبدل الوسط بوسط تمايز ثانٍ طازج. وسيتم تحليل البروتينات المستخلصة من الخلايا بواسطة لطخة ويسترن (western blot) كل 48 ساعة.

يمكن ملاحظة كل خطوة من خطوات إنتاج الخرزات الدقيقة تحت المجهر. تظهر خرزة دقيقة من الألجينات بتكبير 20x. قبل طلاء PLL، وبعد الطلاء بـ PLL، وبعد إذابة لب الجيلاتين في دراسة كمية، تمت مقارنة تعبير adipose triglyceride lipase أو ATGL بين ثلاثة من خلايا 3T3-L1 الدهنية التي تمت زراعتها مشتركاً مع كبسولات دقيقة تحتوي على خلايا دهنية من النوع البري أو خلايا دهنية ناقصة في aldehyde dehydrogenase 1 A1.

يشير التعبير الأعلى لـ A TGL في الخلايا الدهنية التي تمت زراعتها مشتركاً مع L DH one A one deficient to dip cyte المحتواة في كبسولات دقيقة إلى نشاط تحلل دهون أعلى. وفي دراسة أجريت داخل الجسم الحي، تم حقن خلايا مغلفة موسومة بـ GFP في مستودع الدهون داخل البطن للفئران. وبعد 80 يوماً، أظهرت الوسادة الدهنية المحقونة تجمعات ملونة من الخلايا المغلفة.

يظهر مقطع من مستودع الدهون داخل البطن المصبوب في البارافين والمصبوغ بالهيماتوكسيلين والإيوسين تجمعات من الخلايا المغلفة داخل كبسولات دقيقة مزروعة وخلايا دهنية من المضيف. ويُظهر المقطع نفسه عند تحليله تحت الضوء الفلوري خلايا مزروعة موسومة بـ GFP في الجزء الداخلي من كبسولات مستديرة وسليمة. كما يعد التعبير عن GFP مؤشراً على حيوية الخلايا بعد تطويرها.

مهدت تقنية التغليف هذه الطريق للباحثين في مجال الأمراض الأيضية لاستكشاف العلاجات الممكنة للسمنة، ومقاومة الإنسولين في مرض السكري من النوع الثاني، والالتهابات، والسرطان في الكائنات النموذجية.