بسيطة والشم اختبار لالفئران بمساعدة الحاسوب

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار التمييز الشمي الفطري، أو التفضيل الشمي، أو التجنب، أو الحساسية الشمية في الفئران. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض الفأر لجذب أو منفر جديد، ورائحة محايدة، وهي الماء. وفي هذه الأثناء، تقوم كاميرا فيديو بتسجيل جلسة السلوك.

بعد ذلك، يتم تحليل الفيديو باستخدام برنامج Image J وبالاعتماد على الماكرو الموفرة للحصول على الوقت الذي قضاه الحيوان في معايير الرائحة والماء. وتظهر النتائج سلوك التفضيل أو التجنب للروائح مقارنة بالماء بين الأنماط الجينية المختلفة بناءً على التحليل اللاحق بمساعدة الكمبيوتر. وتتمثل الميزة الرئيسية لاختبار الشم هذا مقارنة باستخدام ساحة وشم مخصصة في أنه يستخدم ساحة مألوفة، وبالتالي يتميز بسرعة التنفيذ وبساطة الإعداد.

بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام أجهزة غير مكلفة، وسيقوم Emmanuel Abry، وهو طالب في مختبري، بتوضيح الإجراء. بالنسبة لهذه التجربة، استخدم فئرانًا ذكرًا من سلالة C 57 black، من النوع البري (wild type) والنوع المعدل وراثيًا (transgenic)، وتتراوح أعمارها بين ثلاثة إلى خمسة أشهر. يستخدم هذا العرض التوضيحي خطين من الفئران المعطلة جينيًا (knockout lines) وفئرانًا ضابطة من نفس البطن (litter mate controls).

بالنسبة لساحات التجارب، استخدم أقفاص فئران نظيفة ومعقمة تحتوي على ثلاثة سنتيمترات من مادة الفرش. بعد ذلك، قم بتجهيز إعداد الكاميرا؛ حيث يتم وضعها على ارتفاع 58 سنتيمتر فوق أرضية القفص باستخدام حامل ثلاثي القوائم مخصص.

ضع بعض العلامات على الطاولة لتحديد الموضع الذي يجب أن يكون فيه القفص. للحصول على صورة مركزية، اضبط الكاميرا لتسجيل فيديو بدقة 320 × 240 بكسل وبمعدل 15 إطاراً في الثانية تقريباً. ولتحضير التجربة، احتفظ بمركزات من كل رائحة مخزنة في مذيب كلما أمكن ذلك.

بالنسبة لاختبار التفضيل، قم بتحضير محلول بتركيز 10% وزن/حجم من زبدة الفول السوداني في زيت الفول السوداني. وبالنسبة لاختبار التجنب، استخدم محلولاً بتركيز 98% من حمض methyl butyric. أما بالنسبة لاختبار الحساسية، فقم بجمع بول إناث الفئران من سلالة مماثلة قبل يوم أو يومين من إجراء الاختبار.

يتم تثبيت الأنثى بحيث تكون بطنها فوق شبكة القفص وجمع قطرات من بولها في طبق بلاستيكي. تُجمع عينات من عدة إناث لغرض التنميط. وللتعامل مع التباين الفردي، تُسحب جميع العينات في أنبوب سعة 1.5 milliliter وتُحفظ عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

لبدء عملية تعويد الحيوانات، ضع حيواناً واحداً في قفص نظيف واتركه يستكشف المكان. يجب أن تكون بيئة قفص الاختبار مماثلة لبيئة القفص الأصلي لمدة خمس دقائق. كرر مرحلة التعويد مرة واحدة في كل يوم اختبار، وعند انتهاء فترة التعويد، ابدأ التسجيل واستخدم الماصة لإضافة 60 µL من رائحة زكية.

في هذه الحالة، ضع زبدة الفول السوداني على أحد الجدران، وعلى الجدار المقابل، استخدم الماصة لوضع نفس الكمية من الماء. وبما أن الماء يتميز برائحة محايدة، ضع القطرات على ارتفاع 10 centimeters تقريبًا على كل جدار. الآن اترك الحيوان يستكشف لمدة دقيقتين، ثم أوقف التسجيل وأعد الفأر إلى قفصه الأصلي.

كرر العملية مع كل فأر سيتم اختباره، مع استخدام أقفاص اختبار جديدة دائماً. بعد مرور ثلاثة إلى خمسة أيام من إجراء جميع اختبارات التفضيل، قم بإجراء اختبار التجنب باستخدام قفص اختبار جديد.

أجرِ اختبار التجنب لكل فأر. وكما في اختبار الانجذاب، استبدل الرائحة الممتعة فقط برائحة التجنب، وهي حمض 2-ميثيل بيوتيريك. وبالنسبة لاختبار الحساسية، يمكن إعادة استخدام القفص الواحد بين التجارب لنفس الفأر.

لذا، قم بتمييز جانب المياه في القفص واستعد لتنظيف الجدران القصيرة باستخدام ورق مبلل بـ 70% ethanol بين التجارب. في يوم التجربة، قم بتحضير أربعة تركيزات من البول باستخدام سلسلة تخفيف عشرية. وباستخدام الماء المقطر مرتين كما في اختبار التجنب، قم بتعويد كل حيوان على قفص الاختبار الخاص به لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم تعريض كل فأر للبول بأعلى تخفيف في البداية، وهو 1 إلى 10,000. وأثناء التسجيل، ضع تخفيف البول في قفص الاختبار وضع الماء على الجدار المقابل. وكما هو متبع في الاختبارات الأخرى، اترك الحيوان يستكشف.

لمدة دقيقتين. بعد ذلك، انقل الحيوان إلى قفص فئران نظيف. بعد أن تتعرض جميع الحيوانات لأدنى تركيز، قم بتنظيف جميع جدران أقفاص الاختبار وكرر الاختبار على كل فأر باستخدام البول ذو التركيز الأعلى التالي.

استمر في هذه العملية حتى يتم اختبار البول النقي. بعد جمع كافة البيانات الخاصة بالتجربة، افتح مقاطع الفيديو في برنامج Image J لإجراء التعديلات وتفاصيل المعالجة الموضحة في البروتوكول النصي باستخدام البروتوكولات الموصوفة. خطان مختلفان من سلالات التعطيل الجيني (knockout).

تمت مقارنة المجموعتين B وC بمجموعة الضبط A المكونة من فراش الحيوانات. استُخدم اختبار T للطلاب غير الموجه مع تباين متساوٍ أو غير متساوٍ لمقارنة الوقت الذي قضاه الحيوان بين الرائحة والماء ضمن الأنماط الجينية. كما تمت مقارنة السلوك بين الأنماط الجينية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA). لم تُظهر كلتا المجموعتين التجريبيتين، B وC، أي تفضيل للرائحة الجاذبة. وفي اختبار التجنب، كانت الاستجابة تجاه رائحة حمض 2-ميثيل بوتيريك المنفرة كما هو متوقع للمجموعتين A وB، بينما لم تُظهر المجموعة C أي سلوك تجنب تجاه هذه الرائحة.

في اختبار الحساسية، تم الحصول على عتبة الجذب عن طريق طرح الوقت الذي قضي مع البول من الوقت الذي قضي مع الماء، حيث كان البول مفضلاً على الماء عند تخفيف بنسبة 1 إلى 1000. بينما احتاجت كلتا المجموعتين التجريبيتين، B و c، إلى تركيز أكبر بمقدار 100 ضعف لإظهار التفضيل. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إذا تم أداؤها بشكل صحيح، ومن ثم باتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التعلم الشمي والانطفاء لاستقصاء اللدونة الشمية والتعلم.