تكييف عملية Electrospinning لتوفير ثلاث بيئات فريدة من نوعها لثلاثي الطبقات

الهدف العام من هذا الإجراء هو الغزل الكهربائي لسقالة طورية ثلاثية الأبعاد، مما يسمح بالاستزراع المشترك لخلايا بشرية بالغة متمايزة تماماً من أجل محاكاة المصفوفة خارج الخلوية الطبيعية التي تواجهها هذه الخلايا في C two. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الغزل الكهربائي لسقالة من الألياف الدقيقة مرتبة عشوائياً. وتتمثل الخطوة الثانية في تكوين سقالة ثنائية الطور عن طريق الغزل الكهربائي لطبقة من الألياف النانوية مرتبة عشوائياً مباشرة فوق سقالة الألياف الدقيقة.

بعد ذلك، يتم غزل سِقالة أخرى من الألياف النانوية المصطفة كهربائياً. وتتمثل الخطوة النهائية في استزراع كل سِقالة بنوع الخلايا الخاص بها، ومن ثم زراعة السِقالات معاً في نظام مفاعل حيوي ترويقي كبنية واحدة. وفي النهاية، يمكن تحليل التفاعلات متعددة الخلايا من خلال قياس إطلاق الوسائط والصبغ المناعي.

البنية التصميمية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الأغشية المحولة ثنائية الأبعاد (2D)، في أن السقالات الكهربائية توفر بيئة ليفية ثلاثية الأبعاد (3D) يمكن تكييفها لتوفير مورفولوجيا ذات صلة فسيولوجياً. فهي ذات بنية أكثر مسامية وتسمح بالزراعة المشتركة لأنواع متعددة من الخلايا.

توفر هذه الطريقة منصة مستقرة باستخدام خلايا بشرية من مجموعات مرضية أو سليمة كنموذج في المختبر (in vitro). وسيساعد ذلك في تقليل اعتمادنا على النماذج الحيوانية، التي تعاني من قصور في مدى ملاءمتها للأمراض البشرية، كما سيقلل من عدد الحيوانات المستخدمة في التجارب. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل دراسة الأمراض الالتهابية في الأمعاء، أو تطوير نموذج جلدي للاختبارات الكيميائية.

للبدء، قم بتحضير ثلاثة محلولـات مختلفة من PET بحجم 10 milliliter عن طريق إذابة PET بنسب 8% و 10% و 30% في خلائط متساوية (بنسبة واحد إلى واحد) من كلورو ميثان وحمض ثلاثي كلورو الخليك. قم بتقليب المحاليل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لإذابة PET بحلول اليوم التالي. انقل محلولـات PET إلى محاقن، وثبّت إبرة بقياس 23 gauge في المحقنة التي تحتوي على خليط 8%، وإبراً بقياس 18 gauge في المحقنتين الأخريين اللتين تحتويان على محلولـات PET بنسب 10% و 30%.

قم بتحضير السقالة ذات الألياف الدقيقة. أولاً، ضع المحقنة التي تحتوي على محلول 30%PET في مضخة المحقنة بحيث تكون إبرة المحقنة متجهة للأسفل. ضع الأسطوانة على مسافة 15 سنتيمتر من طرف الإبرة وتأكد من توجيه الإبرة نحو مركز الأسطوانة.

قم بتوصيل خط التغذية الكهربائية الموجب بطرف الإبرة باستخدام مشبك تمساح معدني، وقم بتأريض المنصة عن طريق توصيل خط التأريض بمقبس الموزة. قم بتشغيل المحرك واضبط سرعة المنصة على 60 RPMs. قم بتشغيل مضخة المحقنة لتوفير معدل تدفق قدره 2.0 milliliters per hour.

أثناء إنشاء السقالات الليفية الدقيقة، اترك المضخة تعمل حتى يتم دفع المحلول من طرف الإبرة لتهيئة النظام عن طريق إزالة أي هواء موجود في الإبرة. ثم قم بإيقاف المضخة في مضخة السرنجة.

اضبط الحجم الإجمالي للمحلول المراد دفعه على 2 mL ثم ابدأ بتشغيل المضخة. بعد ذلك، طبق جهداً كهربائياً قدره 14 kV بين الإبرة والعمود الدوار لعملية الغزل الكهربائي لمدة ساعة واحدة، حتى يتم غزل 2 mL من محلول 30%PET كهربائياً. ومع بقاء سِقالة الألياف الدقيقة على العمود الدوار، قم بإيقاف الجهد الكهربائي. أزل مشبك التمساح واستبدل المحقنة التي تحتوي على محلول 30%PET بالمحقنة التي تحتوي على محلول 8%PET.

بعد ذلك، أعد توصيل مشبك التمساح بالإبرة ذات القياس 23 gauge. قم بتغيير معدل تدفق مضخة المحقنة إلى 0.5 milliliters per hour وقم بتجهيز الإبرة عن طريق تشغيل مضخة المحقنة حتى يتدفق المحلول من الطرف. ومع استمرار دوران المندريل بسرعة 60 RPMs، قم بتطبيق جهد كهربائي قدره 14 kilovolt بين طرف الإبرة والمندريل، واضبط الحجم الإجمالي الذي سيتم بثقه بواسطة مضخة المحقنة على two milliliters.

قم بعملية الغزل الكهربائي لمدة أربع ساعات حتى يتم غزل 2 mL من محلول 8%PET. عند اكتمال عملية الغزل الكهربائي، قم بإيقاف تشغيل مزود الطاقة والمحرك الذي يقوم بتدوير المندريل. اقطع السقالة ثنائية الطور باستخدام شفرة على طول عرض المندريل لإنتاج ورقة سقالة ثنائية الأبعاد بحجم مساحة سطح المندريل.

لتحضير سقالات PET المحاذية، قم بتحميل المحقنة التي تحتوي على محلول 10%PET في مضخة المحقنة بحيث تكون سن الإبرة متجهة للأسفل. بعد ذلك، قم بتوصيل مشبك التمساح بالإبرة. اضبط معدل التدفق على 0.5 milliliters per hour وقم بتجهيز الإبرة بمحلول PET.

بعد ذلك، قم بتشغيل المحرك واضبط سرعة دوران المغزل على 2000 RPMs. ثم، قم بتشغيل مضخة المحقنة. اضبط مصدر الجهد الكهربائي على 14 kilovolts وقم بتشغيل وحدة التغذية الكهربائية لعملية الغزل الكهربائي لمدة أربع ساعات حتى يتم غزل 2 milliliters من المحلول كهربائياً.

عند اكتمال عملية الغزل الكهربائي، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة والمحرك. اقطع السقالة باستخدام شفرة على طول عرض المندريل لإنتاج ورقة مسطحة ثنائية الأبعاد (2D) من السقالة المصطفة. تُحفظ السقالات المغزولة كهربائياً في ورق ألومنيوم لتقليل الشحنة الإلكتروستاتيكية.

استخدم قلم خزعة بقطر 0.8 millimeter لثقب أقراص من السقالات ثنائية الطور أو الموجهة من رقائق SPU. بعد ذلك، قم بلصق قرص السقالة ثنائي الطور على حاشية باستخدام غراء أحواض السمك غير السام. ضع الحاشيات والسقالات في طبق زراعة أنسجة يحتوي على 12 بئراً.

قم بتعقيم الحشوات والسقالات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية I لمدة 30 دقيقة على كل جانب من جوانب السقالات. بعد ذلك، انقعها في محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات بتركيز 20% طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C حتى اليوم التالي. اغسل السقالات باستخدام PBS ثلاث مرات واحفظ السقالات في PBS عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت استخدامها.

انقل السقالات ثنائية الطور من محلول PBS إلى طبق 12 Well جديد، وقم بتدفئتها في وسط DMEM مكمل بـ 10%FCS لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees Celsius. قم بإزالة وسط DMEM المكمل، وضع طور الألياف الدقيقة من السقالات، ثم ازرع 15, 000 من خلايا MRC five fibroblast في 30 microliters من وسط DMEM المكمل على كل سقالة للمساعدة في تغلغل الخلايا الليفية داخل السقالة. ضع الطبق على هزاز مداري وقم برج السقالات بسرعة 100 RPMs لمدة ساعتين.

ثم أضف 2 mL من وسط DMEM المكمل إلى كل سِقالة، واحْضن السِقالات طوال الليل عند 37 °C مع 5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، قم بإزالة الوسط من الآبار واقلب السِقالات بحيث تواجه مرحلة الألياف النانوية (nanofiber phase) للسِقالات الجهة القمية. بعد ذلك، قم بزراعة 30,000 من خلايا Cali three epithelial في 30 µL من وسط D-M-E-M-F 12 المكمل بنسبة 10% FCS على مرحلة الألياف النانوية للسِقالة.

يتم تحضين السقالة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide قبل غمر السقالات في خليط بنسبة 70:30 من أوساط DMEM/F12 وDMEM المكملة، والاستمرار في التحضين الساكن لمدة 12 ساعة إضافية لاستزراع خلايا العضلات الملساء في المسالك الهوائية. أولاً، يتم نقل السقالات المصطفة من محلول PBS إلى طبق 12 عين جديد، وتدفئتها مع أوساط DMEM المكملة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ثم تُزال أوساط DMEM المكملة، ويُضاف 25,000 من خلايا العضلات الملساء في المسالك الهوائية في 30 µL من أوساط DMEM المكملة إلى كل سقالة، وتُحضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide.

بمجرد الالتصاق، تُغمر السقالات في وسط DMEM مُدعم. تُعاد السقالات إلى الحاضنة وتُترك طوال الليل قبل إعداد المزرعة الثلاثية في المفاعل الحيوي. وفي اليوم التالي، تُوضع السقالة ثنائية الطور المزروعة في غرفة المفاعل الحيوي بحيث تكون المرحلة الظهارية متجهة للأعلى داخل الغرفة.

بعد ذلك، ضع السقالة المصطفة أسفل السقالة ثنائية الطور بحيث تكون مجاورة لطور الألياف الدقيقة في السقالة ثنائية الطور. أحكم غلق حجرتي المفاعل الحيوي معاً. ثم قم بتجميع دائرتي تدفق تروية داخل حاضنة كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب، وقم بضخ الوسط الغذائي عبر الدائرتين بمعدل 0.1 milliliters per minute تقريباً باستخدام مضخة تمعجية بعد مرور أسبوع واحد.

قم بإزالة الوسط من الحجرة القمية ومن المزرعة. يتم استزراع الخلايا الظهارية عند السطح الفاصل بين الهواء والسائل لمدة أسبوع إضافي قبل التحليل؛ فبعد أسبوعين في المفاعل الحيوي، تم تثبيت وسقالة المزرعة الثلاثية الموضحة هنا وتقطيعها لإظهار نوى الخلايا الموزعة عبر الطبقات الثلاث للبنية، حيث صُبغت نوى الخلايا بـ DPI وتظهر باللون الأزرق بينما تظهر مادة السقالة باللون الرمادي. تظهر هنا صور بالمجهر الإلكتروني الماسح للألياف النانوية المغزولة كهربائياً، والألياف الدقيقة، والسقالات المصطفة التي تم تحضيرها لاستزراع الخلايا الظهارية، والخلايا الليفية، وخلايا العضلات الملساء على التوالي.

أظهرت جميع أنواع الخلايا الثلاثة زيادة في الحيوية عند استنباتها على السقالات الخاصة بكل منها على مدار فترة أسبوعين. كما استمر كل نوع منها في التعبير عن البروتينات الخاصة بنوعه بعد فترة الاستنبات التي استمرت أسبوعين. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر البحث في المصفوفة خارج الخلوية الأصلية التي تحاول إعادة إنشائها باستخدام الألياف الكهربائية.

تتصرف الخلايا بشكل مختلف عند التصاقها بتضاريس ثلاثية الأبعاد (3D) مختلفة. على سبيل المثال، لا تشكل الخلايا الظهارية حاجزاً وظيفياً إلا عند استزراعها على ألياف نانوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية بناء نظام استزراع مشترك متعدد الطبقات، والذي يمكن استخدامه لدراسة التفاعلات بين الخلايا داخل بيئة استزراع ديناميكية.

لا تنسَ أنه من المهم ضبط معلمات الغزل الكهربائي، مثل معدل التدفق والجهد الكهربائي، لتناسب نظام البوليمر والمذيب الذي تنوي استخدامه أثناء تنفيذ هذا الإجراء؛ فهذا أمر بالغ الأهمية لإنتاج الألياف المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك، تذكر إجراء الغزل الكهربائي داخل غطاء سحب أو خزانة مهواة للسماح باستخلاص المذيبات بشكل صحيح.