تكييف عملية Electrospinning لتوفير ثلاث بيئات فريدة من نوعها لثلاثي الطبقات في المختبر نموذج جدار مجرى الهواء

الهدف العام من هذا الإجراء هو الدوران الكهربائي لسقالة طورية ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بالزراعة المشتركة للخلايا البشرية البالغة المتمايزة تماما من أجل تكرار المصفوفة الطبيعية خارج الخلية التي تواجهها هذه الخلايا في C two. يتم تحقيق ذلك عن طريق الغزل الكهربائي الأول ، وهو عبارة عن سقالة من الألياف الدقيقة محاذاة عشوائيا. تتمثل الخطوة الثانية في تشكيل سقالة ثنائية الطور عن طريق الدوران الكهربائي لطبقة من الألياف النانوية محاذاة عشوائيا مباشرة على سقالة الألياف الدقيقة.

بعد ذلك ، يتم نسج سقالة منفصلة من الألياف النانوية المحاذاة للكهرب. تتمثل الخطوة الأخيرة في بذر كل سقالة بنوع الخلية الخاصة بها والزراعة المشتركة للسقالات في نظام مفاعل حيوي غزير كبناء واحد. في النهاية ، يمكن تحليل التفاعلات متعددة الخلايا من خلال قياس إطلاق الوسيط والتلوين المناعي.

البناء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الأغشية المحولة ثنائية الأبعاد ، هي أن السقالات الكهربائية توفر بيئة ليفية ثلاثية الأبعاد يمكن تكييفها لتوفير مورفولوجيا ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. إنه هيكل أكثر مسامية ويسمح بالثقافة الأساسية لأنواع متعددة من الخلايا.

توفر هذه الطريقة نظاما أساسيا مستقرا باستخدام الخلايا البشرية الجماعية أو المريضة أو السليمة كنموذج في المختبر. سيساعد هذا في تقليل اعتمادنا على النماذج الحيوانية ، التي لها قيود في صلتها بالأمراض البشرية وتقليل عدد المستخدمة في التجارب. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل دراسة الأمراض الالتهابية في الأمعاء ، أو لتطوير نموذج جلدي للاختبار الكيميائي.

للبدء ، قم بإعداد ثلاثة محاليل مختلفة سعة 10 ملليلتر من PET عن طريق إذابة 8٪ 10٪ و 30٪ PET في مخاليط فردية من كلورو ميثان وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك. قلب المحاليل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لإذابة PET في اليوم التالي. انقل محاليل البولي إيثيلين تيريفثالات إلى محاقن وقم بتوصيل إبرة قياس 23 بالمحقنة التي تحتوي على خليط 8٪ وإبر قياس 18 إلى المحاقن الأخرى التي تحتوي على محاليل 10٪ و 30٪ PET.

تحضير السقالة المصنوعة من الألياف الدقيقة. أولا ، قم بتحميل المحقنة التي تحتوي على محلول PET بنسبة 30٪ في مضخة الحقنة مع وجود نقطة إبرة في الأسفل. ضع الرجل على بعد 15 سم من طرف الإبرة وتأكد من توجيه الإبرة في وسط الأسطوانة.

قم بتوصيل خط الإمداد الكهربائي الموجب بطرف الإبرة باستخدام مشبك تمساح معدني وطحن الرجل عن طريق توصيل الخط الأرضي بمقبس الموز. قم بتشغيل المحرك واضبط سرعة المخزن على 60 دورة في الدقيقة. قم بتشغيل مضخة الحقنة لتوفير معدل تدفق يبلغ 2.0 مل في الساعة.

أثناء إنشاء السقالات المصنوعة من الألياف الدقيقة. اسمح للمضخة بالعمل حتى يتم بثق المحلول من طرف الإبرة من أجل تجهيز النظام عن طريق إزالة أي هواء في الإبرة. ثم أوقف المضخة على مضخة الحقنة.

اضبط الحجم الإجمالي للمحلول المراد طرده إلى ملليلترين وابدأ تشغيل المضخة. بعد ذلك ، قم بتطبيق إمكانات 14 كيلو فولت بين الإبرة والدوران الكهربائي للمغزل لمدة ساعة واحدة حتى يتم غزل ملليلترين من محلول PET بنسبة 30٪ مع سقالة الألياف الدقيقة التي لا تزال على مغزل إيقاف تشغيل جهد الجهد. قم بإزالة مشبك التمساح واستبدل المحقنة التي تحتوي على محلول 30٪ PET بالمحقنة التي تحتوي على محلول 8٪ PET.

ثم أعد توصيل مشبك التمساح بإبرة قياس 23. قم بتغيير معدل تدفق مضخة الحقنة إلى 0.5 مل في الساعة وقم بتجهيز الإبرة عن طريق تشغيل مضخة الحقنة حتى يتدفق المحلول من الحافة. مع استمرار المغزل في الدوران عند 60 دورة في الدقيقة ، قم بتطبيق جهد 14 كيلو فولت بين طرف الإبرة والمغزل ، واضبط الحجم الإجمالي الذي سيتم بثقه بواسطة مضخة الحقنة ليكون ملليلترا.

يدور كهربائيا لمدة أربع ساعات حتى يتم غزل ملليلترين من محلول PET بنسبة 8٪. عند اكتمال الغزل الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة والمحرك الذي يقوم بتدوير المغزل. قطع السقالة ثنائية الطور بشفرة على طول عرض المغزل لإنتاج ورقة ثنائية الأبعاد من السقالة بحجم مساحة سطح المغزل.

لتحضير سقالات PET المحاذاة ، قم بتحميل المحقنة التي تحتوي على محلول PET بنسبة 10٪ في مضخة الحقنة مع وجود نقطة إبرة في الأسفل. ثم قم بتوصيل مشبك التمساح بالإبرة. اضبط معدل التدفق على 0.5 مل في الساعة وقم بتجهيز الإبرة بمحلول PET.

ثم قم بتشغيل المحرك واضبط سرعة دوران المغزل على 2000 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتشغيل مضخة المحقنة. اضبط مصدر الجهد على 14 كيلو فولت وقم بتشغيل الدوران الكهربائي لمصدر الطاقة لمدة أربع ساعات حتى يتم غزل ملليلترين من المحلول.

عند اكتمال الغزل الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة والمحرك. قطع السقالة بشفرة على طول عرض المغزل لإنتاج ورقة ثنائية الأبعاد محاذاة من السقالة. قم بتخزين السقالات الكهربائية المغزولة في ورق الألمنيوم لتقليل الشحنة الكهروستاتيكية.

استخدم قلم خزعة بقطر 0.8 ملم لإخراج أقراص من السقالات ثنائية الطور أو محاذاة من صفائح SU. ثم قم بلصق قرص السقالة ثنائي الطور على حشية باستخدام غراء حوض السمك غير السام. ضع الحشيات والسقالات في لوحة زراعة أنسجة 12 جيدا.

عقم الحشيات والسقالات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية I لمدة 30 دقيقة على كل جانب من جوانب السقالات. ثم انقع في محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات بنسبة 20٪ طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. اغسل السقالات ب PP S3 مرات وقم بتخزين السقالات في PBS عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامها.

انقل السقالات ثنائية الطور من PBS إلى طبق جديد مكون من 12 بئر وقم بتسخينها في وسائط DMEM مكملة ب 10٪ FCS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الوسائط المكملة ب DMEM وضع مرحلة الألياف الدقيقة للسقالات aply البذور 15 ، 000 MRC خمس خلايا ليفية في 30 ميكرولتر من الوسائط المكملة ب DMEM على كل سقالة لمساعدة الخلايا الليفية على اختراق السقالة. ضع اللوحة على شاكر مداري وحرك السقالات بسرعة 100 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.

ثم أضف ملليلترين من الوسائط المكملة ب DMEM إلى كل سقالة واحتضان السقالات طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسائط من الآبار واقلب السقالات بحيث تواجه مرحلة الألياف النانوية للسقالات قميا. ثم بذرة 30 ، 000 كالي ثلاث خلايا ظهارية في 30 ميكرولترا من وسائط D-M-E-M-F 12 مكملة ب 10٪ FCS على مرحلة الألياف النانوية للسقالة.

احتضان السقالة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل غمر السقالات في خليط 70 30 من الوسائط المكملة D-M-E-M-F 12 و DMEM والاستمرار في الحضانة الساكنة لمدة 12 ساعة إضافية لزراعة مجرى الهواء. قم أولا بنقل السقالات المحاذاة من PBS إلى صفيحة جديدة مكونة من 12 بئر وقم بتسخينها ووسائط DMEM المكملة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الوسائط المكملة ب DMEM وأضف 25,000 خلية عضلية ملساء في مجرى الهواء في 30 ميكرولترا من الوسائط المكملة ب DMEM إلى كل سقالة واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بمجرد توصيلها ، اغمر السقالات في وسائط مكملة ب DMEM. أعدهم إلى الحاضنة واتركهم طوال الليل قبل إنشاء ثقافة ثلاثية في المفاعل الحيوي. في اليوم التالي ، ضع سقالة البذور ثنائية الطور في غرفة المفاعل الحيوي بحيث تكون المرحلة الظهارية متجهة لأعلى في الغرفة.

ثم ضع السقالة المحاذاة أسفل السقالة ثنائية الطور بحيث تكون مجاورة لمرحلة الألياف الدقيقة للسقالة ثنائية الطور. قفل غرفتي المفاعل الحيوي معا. ثم قم بتجميع دائرتين لتدفق التروية داخل حاضنة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ووسائط المضخة حول الدائرتين بسرعة 0.1 ملليلتر تقريبا في الدقيقة باستخدام مضخة تمعجية بعد أسبوع واحد.

قم بإزالة الوسائط من الغرفة القمية والثقافة. الخلايا الظهارية في واجهة سائل الهواء لمدة أسبوع إضافي قبل التحليل بعد أسبوعين في المفاعل الحيوي ، تم إصلاح سقالة الثقافة الثلاثية الموضحة هنا وتقسيمها لإظهار نوى الخلية الموزعة في جميع الطبقات الثلاث من نوى الخلية المبنية ملطخة ب DPI وتظهر باللون الأزرق حيث تظهر مادة السقالة باللون الرمادي. فيما يلي صور مجهر إلكتروني للسقاطات الدقيقة المغزولة من الألياف النانوية والسقالات المحاذاة التي تم إعدادها لبذر الخلايا الظهارية والخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء على التوالي.

أظهرت جميع أنواع الخلايا الثلاثة زيادة في الجدوى عند زراعتها على سقالاتها الفردية على مدى أسبوعين. استمر كل منهم أيضا في التعبير عن بروتينات معينة من نوع الخلية بعد فترة الزراعة التي استمرت أسبوعين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر البحث عن المصفوفة الأصلية خارج الخلية التي تحاول إعادة إنشائها باستخدام ألياف الإلكتروس.

ستتصرف الخلايا بشكل مختلف عند الارتباط بصور ثلاثية الأبعاد مختلفة. على سبيل المثال ، لن تشكل الخلايا الظهارية حاجزا وظيفيا إلا عند زراعتها على ألياف النانو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء نظام ثقافة مشتركة متعدد الطبقات ، والذي يمكن استخدامه لدراسة التفاعلات بين الخلايا داخل بيئة ثقافة ديناميكية.

لا تنس أنه من المهم تخصيص معلمات الغزل الكهربائي الخاصة بك ، مثل معدل التدفق والجهد لتناسب نظام البوليمر والمذيبات الذي تنوي استخدامه أثناء تنفيذ هذا الإجراء. هذا أمر بالغ الأهمية في توليد الألياف المرغوبة. بالإضافة إلى ذلك ، تذكر أن تختار تدوير غطاء أو خزانة ذات فتحات تهوية للسماح باستخراج المذيبات بشكل صحيح.