طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال المتصورة المنجلية

تنتقل microRNAs البشرية من كريات الدم الحمراء المضيفة إلى طفيليات المتصورة المنجلية. هنا ، يتم وصف التقنيات المستخدمة لنقل microRNAs الاصطناعية إلى كريات الدم الحمراء المضيفة وعزل جميع الحمض النووي الريبي من P. falciparum. بالإضافة إلى ذلك ، ستفصل هذه الورقة طريقة لعزل متعدد الجمرات في المتصورة المنجلية لتحديد شغل الريبوسومات وإمكانات الترجمة لنصوص الطفيليات.

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة دور الحمض النووي الريبي الميكروي لكريات الدم الحمراء في تنظيم الجينات بعد النسخ لنصوص المتصورة المنجلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الملاريا ، مثل كيف يمكن أن تؤثر أحداث تضفير الحمض النووي الريبي مع الحمض النووي الريبي الصغير المضيف أو الطفيلي على الإمكانات الانتقالية ل mRNAs الاندماجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على التقاط الحمض النووي الريبي الكلي والصغير معا في مجموعة واحدة ، مما يدل على وجود الحمض النووي الريبي الصغير والحمض النووي الريبي الاندماجي في خلية واحدة.

بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم هذا الإجراء التنميط متعدد الجدولة لإظهار كيفية تأثير هذه الحمض النووي الريبي الصغير على ترجمة منتجات الرنا المرسال للاندماج. للبدء ، قم بإعداد التعدي بمقدار سنتيف 300 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء في وسط الملاريا الكامل عند 800 مرة جم لمدة خمس دقائق. اغسل كريات الدم الحمراء مرتين بوسط RPMI ، وأعد تعليق الخلايا في مزيج سيتو كامل بنسبة 50٪ هيماتوكريت.

بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى جهاز التثقيب الكهربائي وأضف 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الصغير المترافق مع البيوتين DYS أو الحمض النووي الريبي الصغير للتحكم السلبي غير المترافق لتزويد الخلايا بالكهرباء ، ضع القرص في مثقب كهربائي وقم بتوصيل نبضة واحدة. ثم قم بتقطيع الخلايا وإصابتها بالمتصورة المنجلية بعد أربع ساعات كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم أضف 50 ميكرولترا من الخرز المعبأ والمجرد إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الطفيلي في أنبوب ميكروسنتر ، واحتضن الأنبوب مع الدوران لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بالطرد المركزي لشريط دافان والخرز عند 800 مرة G لمدة 30 ثانية ، ثم اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RNP الذي يحتوي على تخفيف واحد إلى 1000 من مثبط الحمض النووي الريبي. العزف التالي ، الحمض النووي الريبي من الخرزات بواسطة Resus ، معلقها في 200 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي.

التقاط المخزن المؤقت للشطف الذي يحتوي على البيوتين الزائد. احتضان الخرز طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الدوران. ثم قم بالطرد المركزي للحبات عند 800 مرة G لمدة 30 ثانية واجمع الحمض النووي الريبي الطافي.

من الأهمية بمكان التخلص من فائض البيوتين واستخدام الحد الأدنى من البكتيريا العقدية والخرز لضمان الشطف المحدد المناسب. هذا يقلل من تخصيب الحمض النووي الريبي في الخلفية. أخيرا ، حدد درجة تخصيب نسخ P falciparum وتخصيب الحمض النووي الريبي الدقيق بواسطة R-T-P-C-R الكمي كما هو موضح في بروتوكول النص لبدء فصل متعدد الأطوار.

ضع أولا خمسة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 50٪ في أنبوب الطرد المركزي الفائق. ثم ضع بعناية خمسة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 15٪ فوق محلول 50٪. بعد ذلك ، أغلق الأنبوب المتدرج بالبيرفيل وقم بإمالة الأنبوب بعناية حتى يقع أفقيا على سطح المنضدة.

تأكد من أن الأنبوب في وضع مستقر لمنع التدحرج. احتفظ بالأنبوب في هذا الوضع لمدة ساعتين على الأقل للسماح بالتدرج بالتكون. في غضون ذلك ، اجمع ما يقرب من 100 مل من ثقافة غير متزامنة للدم المصاب بالمتصورة بنسبة ثلاثة إلى 5٪ من الدفع.

ثم أضف 10 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على اثنين من المليمولار cyclo ، heide ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة G لمدة سبع دقائق ثم اغسلها مرتين باستخدام 80 مل من PBS تحتوي على 200 ميكرومولار cyclo heide resus. الحبيبات في PBS مع cycloheximide وضعها على الجليد.

حبيبات الخلايا وإزالة المادة الطافية لتقدير حجم الحبيبات. ثم قم بتجميع الخلايا في حجم نهائي يبلغ 4.25 مل من التحلل ، وقم باحتضانة واحتضانها لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية مع الدوران. كشفت المحاولات السابقة للتنميط متعدد الجسيمات والأنواع المسببة للملاريا في الغالب أن تحلل الجسور يؤدي إلى انهيار متعدد الجمرات إلى مناطق أحادية.

هنا نستخدم عازلة التحلل التي تحلل كريات الدم الحمراء والطفيليات في وقت واحد للحفاظ على نمط متعدد الجوم من المتصورة المنجلية ، ونقل المحللة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ثم تدور عند 16 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. في أنبوب منفصل مبرد مسبقا خمسة ملليلتر من الطرد المركزي ، أضف 1.25 مل من محلول وسادة السكروز البارد 0.5 مولار باستخدام حقنة بإبرة قياس 27. ضع طبقة بعناية 3.75 مل من المادة الطافية المحللة فوق وسادة السكروز.

الطرد المركزي العينة عند 366،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 146 دقيقة. خلال هذا الوقت ، أعد أنبوب الطرد المركزي الفائق ذبح السكروز ببطء إلى الوضع الرأسي واتركه يقف على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد إزالة المحللة من جهاز الطرد المركزي الفائق ، اجمع المادة الطافية بعناية في مخروطية الشكل سعة 15 ملليلترا.

قم بتخزين المادة الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للحفاظ على جزء الحمض النووي الريبي غير المرتبط بالريبوسومات. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق حبيبات الريبوسوم في 500 ميكرولتر من تعليق Resus ، وقم بالعازلة عن طريق سحب العينة لمدة خمس دقائق لخلط الطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. لإزالة المواد غير القابلة للذوبان ، قم بإزالة ختم المعلمة بعناية على أنبوب التدرج لتجنب إزعاج التدرج ، ثم ضع طبقة من التعليق الريبوزومي في الأعلى باستخدام حقنة وإبرة قياس 27.

بعد الطرد المركزي للأنبوب عند 200 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 180 دقيقة ، قم بتخزين التدرجات عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتحميل على المجزأ. ضع أنبوب طرد مركزي فارغ في مجزأ التدرج واغسل النظام بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي لمدة خمس دقائق. أثناء الغسيل ، اضبط حساسية كاشف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية على 254 نانومتر إلى 0.2.

على الرغم من أن هذا قد يحتاج إلى تعديل اعتمادا على الإشارة. بعد ذلك ، اضبط إشارة خط الأساس على الصفر أثناء تدفق الماء عبر الكاشف. بعد غسل المجمع ، اعكس تدفق السائل عبر المجزأ لتفريغ الخطوط ثم قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الفارغ.

قم بتشغيل محلول سكروز بنسبة 60٪ من خلال FRACTIONATOR حتى يخرج من جهاز الإبرة. ثم ضع أنبوب التدرج المحمل في الجزء العلوي من غرفة التحميل وشد الختم. اخترق الجزء السفلي من الأنبوب بالإبرة.

ثم أعد ضبط سرعة تدفق المجزأ إلى 12.5 × 10 واجمع 18 ثانية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ابدأ التدفق الأمامي لمحلول السكروز بنسبة 60٪ لتصفية الكسور قبل أن تدخل القطرة الأولى من محلول التدرج إلى أنبوب طرد مركزي صغير. ابدأ كل من التجميع والتسجيل المباشر للامتصاص عند إشارة 254 نانومتر.

عندما تنخفض إشارة الامتصاص بشكل حاد عند واجهة محلول السكروز بنسبة 50٪ و 60٪ ، أوقف التدفق والتسجيل. قم بتخزين الكسور المتدرجة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. ثم اعكس تدفق السائل حتى يفرغ محلول 60٪ من أنبوب الطرد المركزي الفائق.

قم بإزالة الأنبوب وابدأ في تحليل التدرج التالي. كشف تعداء خلايا الدم الحمراء باستخدام microRNA 4 5 1 ، متبوعا باستعادة الهجينة الدقيقة NA mRNA الحيوية عن إثراء نصوص اندماج PKAR. لم يثري تعداء الحمض النووي الريبي الصغير الوهمي أو غير ذي الصلة نسخة PKAR.

تظهر البيانات القمم الإيلوسية للوحدات الفرعية الريبوزومية 40 ثانية و 60 ثانية ، والريبوسوم DS والكسور المتعددة التي تحتوي على العدد المحدد من الريبوسومات. ارتبطت الريبوسومات بالنسخ المعزولة من PCI الموجودة داخل خلايا الدم الحمراء. أظهر تحليل الدم الشمالي أن الريبوسومات والبوليسومات مرتبطة ب 18 S و 28 SRNA.

إلى جانب هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل هضم R nase H ، ومقايسات حماية الريبونوكلياز ، والنشاف الشمالي من أجل التحقق بشكل إضافي من وجود microRNA MR. اندماجات NA. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل microRNAs إلى كريات الدم الحمراء ثم التقاط الحمض النووي الريبي الصغير بإجمالي الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك النصوص الخيمرية يجب أن تكون قادرا أيضا على استعادة polysome لتحديد إشغال الريبوسومات وبالتالي الإمكانات الانتقالية لنصوص الاندماج هذه.