العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل الأبواغ الداخلية البكتيرية عن عينات المجتمع الميكروبي المعقدة ، مثل الرواسب تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة حول وجود ووفرة الأبواغ الداخلية في العينات الطبيعية. يعتمد على اختلاف في المقاومة بين الأبواغ الداخلية والخلايا الخضرية للمواد الكيميائية والحرارة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الطريقة غير مدمرة للأبواغ الداخلية بحيث يمكن استخدامها في التجارب النهائية مثل الزراعة والقياس الكمي واختبار التمثيل الغذائي.

على الرغم من أننا صممنا هذه الطريقة للعمل مع بيئة البكتيريا المكونة للأبواغ الداخلية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا في مجالات مثل علم الأحياء الخارجية أو صناعة الأغذية ، حيث يمكن أن تكون الجراثيم مفيدة أو ضارة. بعد تحضير المحاليل والمعدات وفقا لبروتوكول النص ، تحت خزانة السلامة الحيوية المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية ، استخدم مجارف معدنية ملتهبة بالإيثانول لإضافة ثلاثة جرامات من عينة الرواسب إلى أنابيب معقمة سعة 50 ملليلتر ومعقمة مسبقا. باستخدام سحاحة معقمة ومتدرجة ، أضف 15 مل من محلول سداسي ميتافوسفات الصوديوم المعقم أو المصفى بنسبة 1٪ أو SHMP إلى العينة.

باستخدام مشتت سائل أو خالط ودوار تشتت معقم ، قم بتجانس العينة عند 17 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. دع العينة ترتاح لمدة دقيقتين وكرر التجانس. اترك العينة ترتاح لمدة 10 دقائق حتى تستقر أثقل الجسيمات.

انقل المادة الطافية التي تحتوي على الكتلة الحيوية للخلية إلى أنبوب نظيف سعة 50 مليلتر ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. أضف 15 ملليلترا أخرى من SHMP إلى الحبيبات المترسبة وكرر التجانس قبل جمع المادة الطافية ودمجها مع الحصة الأولى. قم بالطرد المركزي للعينة عند 20 مرة G لمدة دقيقة واحدة وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر قبل التخلص من الحبيبات.

بمجرد تحضير وحدة الترشيح ومضخة التفريغ وفقا لبروتوكول النص ، استخدم لهب الإيثانول لتعقيم الملقط لإضافة غشاء النيتروسليلوز المعقم إلى وحدة الترشيح. أضف نصف عينة المادة الطافية المعدة للتو إلى وحدة الترشيح الغشائي واستخدم مضخة التفريغ لجمع الخلايا الموجودة على الغشاء. عندما يمر السائل بالكامل عبر الفلتر ، أوقف مضخة التفريغ.

استخدم ملقطا معقما لإزالة الغشاء بعناية ووضعه في طبق بتري معقم. باستخدام قطعة جديدة من الغشاء المعقم ، كرر الترشيح مع النصف المتبقي من المحلول. لفصل الأبواغ الداخلية عن الخلايا الخضرية في الكتلة الحيوية التي تم جمعها للتو ، قم بإذابة الغشاء إذا تم تجميده واستخدم مقص معقم ملتهب بالإيثانول لتقطيعه إلى قطع أصغر.

انقل قطع الغشاء إلى أنبوب معقم سعة ملليلتر وأضف 900 ميكرولتر من 1X TE BUFFER. تخلط جيدا عن طريق الدوامة لتحرير الكتلة الحيوية من الغشاء. احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

ثم أخرج الأنبوب من الحاضنة واتركه يبرد لمدة 15 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من الليزوزيم المحضر حديثا إلى التركيز النهائي البالغ ملليغرامين لكل مليلتر واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة لتحلل الخلايا الخضرية. بعد اكتمال التحلل ، أضف 250 ميكرولتر من 3 هيدروكسيد الصوديوم العادي و 250 ميكرولتر من محلول SDS بنسبة 6٪ إلى العينة.

احتضن في درجة حرارة الغرفة و 80 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد وحدة ترشيح معقمة تحتوي على أغشية قطرها 25 ملم عن طريق التعقيم. بعد أن تبرد وحدة الترشيح ، ضع عليها غشاء نيتروسليلوز بقطر 25 ملم 0.2 ميكرومتر.

أضف العينة إلى الغشاء واستخدم مضخة التفريغ لتصفية السائل ، والتقاط الأبواغ الداخلية على الغشاء ، بينما تمر مادة الخلية الخضرية من خلالها. لغسل المنظفات المتبقية ، أضف ملليلترين من المحلول الفسيولوجي المعقم إلى الغشاء وقم بتطبيق مضخة التفريغ. عندما يتم ترشيح السائل بالكامل ، قم بإيقاف تشغيل المضخة واترك الغشاء على وحدة الترشيح.

لإجراء معالجة DNase مباشرة على الغشاء ، أضف 450 ميكرولترا من الماء المعقم ، و 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتفاعل 1X DNase و 0.5 ميكرولتر من إنزيم DNase على الغشاء واتركه عند حوالي 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يتم هضم الحمض النووي خارج الخلية الذي تم إطلاقه مسبقا من الخلايا المحللة إنزيميا ثم يتم غسله. هذا يضمن أن مستحضر الأبواغ النهائي خال من الحمض النووي الخارجي وهو أمر أساسي للتحليل النهائي مثل التحليل الجزيئي.

المهم أن تتذكر أنه يجب ألا يكون هناك تسرب على جهاز الفلتر ، ولا تجف العينة. بعد الحضانة ، أضف ملليلترا واحدا من المحلول الفسيولوجي وقم بتشغيل المضخة لغسل الإنزيم المتبقي من العينة. استخدم ملقطا معقما لنقل الغشاء الذي يحتوي على الأبواغ الداخلية إلى طبق بتري معقم.

قم بتحليل العينة وفقا لبروتوكول النص. ينتج عن البروتوكول الموضح في هذا الفيديو للتحلل المستهدف للخلايا الخضرية عينة من الأبواغ الداخلية المنقاة وزيادة كبيرة في جزء الأبواغ الداخلية المكونة للحشية. في تسلسل أمبليكون لجين الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S ، تتوافق الحزم في العينات غير المعالجة مع 8٪ إلى 19٪ فقط من التسلسلات.

في المقابل ، مثلت الحشوات بعد العلاج 90.6٪ و 83.9٪ من العينة الغنية بالإندوسبورين. تم إثراء الرتبتين الرئيسيتين من الأوبوغ الداخلية المكونة للصليات والصليات بينما كانت الصليات غير المكونة للأبواغ الداخلية غائبة مثل العصيات اللبنية. كما تم إثبات كفاءة العلاج باستخدام الثقافات النقية.

تمت معالجة مستحضر الأبواغ الداخلية وزراعة الخلايا الخضرية ، وتم تحضين جميع الخلايا وتم قياس النمو بكثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر. كما هو موضح هنا ، لوحظ نمو لمزارع الأبواغ الداخلية ، بينما لم يلاحظ أي نمو في ثقافة الإشريكية القولونية المعالجة ، مما يشير إلى أن الخلايا الخضرية تضررت بشكل لا رجعة فيه. بمجرد إتقانها ، وإذا تم إعداد الحلول والمعدات مسبقا ، فيجب أن تتم هذه التقنية في حوالي خمس ساعات.

المهم أن تتذكر تجنب جميع التلوث من خلال العمل في ظل ظروف معقمة وضمان عقم المحاليل وجميع المعدات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الزراعة والعزل واختبار التمثيل الغذائي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول تحديد السلالة وإمكانات التمثيل الغذائي للأبواغ الداخلية. أيضا ، يمكن إجراء استخراج الحمض النووي في اتجاه مجرى النهر والتسلسل الميتاجينومي لتحليل تنوع الأنواع ووجود الجينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل الأبواغ الداخلية عن العينات البيئية. لا تنس أن العمل مع المنظفات مثل SDS يمكن أن يكون خطيرا للغاية. لا تنس ارتداء معدات الحماية الشخصية.