إليسا القائم وتجليد وأسلوب المنافسة لتحديد بسرعة التفاعلات يجند مستقبلات

تتمثل أهداف هذه الطريقة القائمة على ELISA أولا في تحديد تقارب ارتباط السيتوكين بمستقبله وثانيا ، لقياس تأثيرات الحجب للببتيدات المثبطة لتفاعل الترابط بين مستقبلات الترابط. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعلات البروتين والبروتين ، مثل ربط مستقبلات السيتوكين. قد تؤدي الصلات الملزمة والحصار إلى زيادة الفهم العام لديناميكيات التفاعل.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الأداء ، فهي تولد مستقبلات الملصقات ، وهي رخيصة نسبيا ، نظرا لسهولة الوصول إلى قارئ ELISA. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعل مستقبلات السيتوكين ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التفاعلات العامة بين البروتين والبروتين وتصميم مركبات الحجب لتثبيط التفاعلات المحددة. قم بإعداد الحلول كما هو موضح في بروتوكول النص.

تأكد من تصفية المخزن المؤقت لطلاء الكربونات بغشاء PES 0.22 ميكرون. استخدم فراغ. أيضا ، قم بعمل 10 تركيزات مختلفة من كل رابط أو ببتيد.

هناك نوعان من المقايسات الموصوفة في هذا الفيديو ، الأول هو التفاعل المباشر لمستقبلات الترابط ، ELISA. يمكن استخدامه لقياس ثابت تفكك المستقبل والترابط ، والذي يمثل تقارب ربط المستقبل والترابط. الاختبار الثاني هو تفاعل الترابط بين مستقبلات المنافسة ELISA الأمثل مؤخرا.

هذا يسمح بفحص الببتيدات والمركبات الحاسرة الأخرى ، والتي تعمل على التداخل مع تفاعل المستقبل والترابط. لتحقيق الكفاءة، استعد لاستخدام الماصات متعددة القنوات للألواح ذات 96 بئرا، وعند الصب، ما عليك سوى تفريغ محتوياتها. ابدأ هذا الإجراء بطلاء اللوحة بمستقبل مؤتلف.

أولا ، قم بتخفيف المستقبل في مخزن كربونات إلى 100 نانوجرام لكل ميكرولتر. ثم قم بتحميل آبار الألواح ب 100 ميكرولتر من محلول المستقبلات. استبعد الجدران الخارجية لتجنب التعامل مع قطعة أثرية لحافة اللوحة.

غطي الطبق واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. قم بإجراء جميع حضانات الألواح مع دوامة لطيفة. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء وغسل اللوحة ثلاث مرات بمحلول الغسيل ، PBS بلمسة من Tween 20.

بعد ذلك ، قم بحظر مواقع ربط المستقبلات الحرة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 5٪ PSA. دع اللوحة تحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لإكمال الكتلة. في وقت لاحق ، أفرغ الآبار واغسل الطبق كما كان من قبل.

الآن ، قم بتحميل الآبار ب 100 ميكرولتر من التخفيفات المختلفة لترابط علامته المؤتلف. قم بتحميل كل تركيز في نسختين. قم بتحميل الآبار الفارغة باستخدام PBS وحده.

ثم احتضن الطبق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة مع الروابط ، اغسل الطبق ثلاث مرات بمحلول الغسيل. بعد ذلك ، قم بإدخال 100 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة الأولي المضاد للفأر في كل بئر واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بعد غسل الجسم المضاد ، أضف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة IGG الثانوي الماعز المضاد للفأر. لف اللوحة بورق الألمنيوم لتجنب الضوء. ثم احتضن الطبق لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

استخدم تقنية الغسيل القياسية لإزالة الجسم المضاد الثانوي. الآن ، إلى كل بئر ، أضف 100 ميكرولتر من TMB المحضر حديثا والمصنوع من كميات متساوية من محاليل الركيزة A و B. ثم احتفظ باللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ثم ، بعد تطوير اللون الكافي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول المرق إلى كل بئر.

يعتمد البروتوكول على افتراض أن الإشارة المرسلة تثير من ربط معين. قد يكون من الضروري تقدير مساهمة الارتباط غير المحدد للإشارة. بعد ذلك ، اقرأ قيم امتصاص اللوحة عند 450 نانومتر واستمر في حساب قيمة KD.

يتبع إجراء LRA للمنافسة نفس الخطوات التي يتبعها الإجراء المباشر لجيش الرب للمقاومة، باستثناء بعض التغييرات الهامة. بعد غسل روابط الطلاء الزائدة من اللوحة ، قم بسد آبار اللوحة. أضف 200 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 5٪ لكل بئر واحتضن اللوحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد روابط علامته المؤتلفة بتركيز ثابت قدره 10 نانوغرام لكل مليلتر في PBS. بعد ذلك ، قم بإعداد الببتيد المانع بتركيزات مختلفة في PBS ، تتراوح من 10 نانومولار إلى 100 ميكرومولار لضمان منحنى استجابة الجرعة. وبالتالي ، يمكن العثور على قيمة IC50 للببتيد الحظر.

في آبار التحكم ، قم بتحميل تركيز الترابط الثابت بدون الببتيد لاشتقاق الحد الأقصى للربط. في الآبار الفارغة ، أضف فقط PBS بدون ترابط أو ببتيد. في الآبار الأخرى ، أضف 50 ميكرولترا من الروابط و 50 ميكرولترا من كل تركيز من الببتيد.

ثم احتضن الطبق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة واستمر كالمعتاد. تم تحديد ثوابت التفكك بين ثلاثة ببتيدات مختلفة من ترابط الإنترفيرون والوحدة الفرعية لمستقبلات ألفا IL28R-a باستخدام LRA المباشر ، ويتم رسم جزء مواقع الارتباط المشغولة مقابل لوغاريتم تركيز الإنترفيرون المعني. توضح هذه النتائج منحنى ربط يمكن تحليله لتقدير قيمة الديكورات الكويتية عن طريق ملاءمة البيانات لمعادلة هيل.

توضح مخطط Scatchard التعاون في ربط الترابط ، وفي النهاية يحتوي ترابط الإنترفيرون 1 على أعلى تقارب ربط ، يليه رابط الإنترفيرون 2 ورابط الإنترفيرون 3. تشير قيمة معامل هيل لأكثر من 1 إلى زيادة التقارب مع الروابط الإضافية بعد تفاعل مستقبلات الترابط الأولي. بعد ذلك ، تم استخدام LRA التنافسي لقياس تأثير الببتيد المانع على التفاعل بين ببتيدات ترابط الإنترفيرون والوحدة الفرعية للمستقبلات.

رسم جزء مواقع الربط المشغولة لببتيد ترابط الإنترفيرون عند 10 نانوغرام لكل مليلتر مقابل سجل تركيز ببتيد الإنترفيرون. من هذه البيانات ، تم تقدير قيم IC50. وفقا للقيم المحسوبة ، فإن الببتيد المانع يثبط التفاعل بين ترابط الإنترفيرون 3 و IL28R-a إلى أقصى حد.

بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في ثماني ساعات. إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل تركيز تشبع لارتباط مستقبلات الترابط ، باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ الطرق الأخرى للحصول على قيم دينار كويتي أكثر تفصيلا.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تفاعلات مستقبلات الترابط لاستكشاف المواد المثبطة لمنع هذه التفاعلات.