إليسا القائم وتجليد وأسلوب المنافسة لتحديد بسرعة التفاعلات يجند مستقبلات

الأهداف من هذه الطريقة القائمة على ELISA هي أولاً تحديد قدرة ارتباط السيتوكين بمستقبله وثانياً، قياس تأثيرات الحجب من الببتيدات المثبطة لتفاعل الرابط-المستقبل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تفاعلات البروتين-البروتين، مثل ارتباط السيتوكين-المستقبل. قد يزيد فهم قوى ارتباط هذه التفاعلات وإمكانية حجبها من الفهم العام لديناميكيات التفاعل.

المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الأداء، وتنتج مستقبلات مميزة، وهي رخيصة نسبياً، نظراً لسهولة الوصول إلى الأدوات المتاحة مثل قارئ ELISA. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعل السيتوكين-المستقبل، يمكن أيضاً تطبيقها على أنظمة أخرى مثل تفاعلات البروتين-البروتين العامة وتصميم مركبات الحجب لمنع التفاعلات المحددة. قم بتحضير المحاليل كما هو موضح في بروتوكول النص.

تأكد من ترشيح مخزن طلاء الكربونات باستخدام غشاء PES بحجم 0.22 ميكرون. استخدم فراغ. قم أيضاً بتحضير 10 تركيزات مختلفة لكل من الرابط أو الببتيد.

هناك اختباران موصوفان في هذا الفيديو، الأول هو تفاعل الرابط-المستقبل المباشر، ELISA. يمكن استخدامه لقياس ثابت تفكك الرابط-المستقبل، الذي يمثل قدرة ارتباط الرابط-المستقبل. الاختبار الثاني هو اختبار تفاعل الرابط-المستقبل المتنافس المحسن مؤخراً، ELISA.

يسمح هذا بفحص الببتيدات والمركبات المثبطة الأخرى، التي تعمل على التدخل في تفاعل الرابط-المستقبل. من أجل الكفاءة، قم بتحضير استخدام مضخات متعددة القنوات لألواح 96 بئر، وعند الصب، قم بإفراغ محتوياتها فقط. ابدأ هذه الإجراء بتغطية اللوحة بمستقبل متماثل.

أولاً، قم بتخفيف المستقبل في مخزن الكربونات إلى 100 نانوغرام لكل ميكرولتر. ثم، قم بتحميل بئر اللوحة بـ 100 ميكرولتر من محلول المستقبل. استبعد الجدران الخارجية لتجنب التعامل مع أثر حافة اللوحة.

قم بتغطية اللوحة وحضنها في درجة حرارة 4 مئوية طوال الليل. قم بأداء جميع حضانات اللوحة مع تذبذب لطيف. في اليوم التالي، قم بإزالة محلول الطلاء وغسل اللوحة ثلاث مرات بمحلول الغسل، PBS مع لمسة من Tween 20.

بعد ذلك، قم بحجب مواقع ربط المستقبل الحرة بإضافة 200 ميكرولتر من 5٪ PSA. دع اللوحة تحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لإكمال الحجب. في وقت لاحق، قم بإفراغ البئر وغسل اللوحة كما هو الحال من قبل.

الآن، قم بتحميل البئر بـ 100 ميكرولتر من التخفيفات المختلفة للرابط المؤتلف المميز بالهيستو-تاجز. قم بتحميل كل تركيز بشكل مزدوج. قم بتحميل البئر الفارغة بـ PBS فقط.

ثم، قم بحضن اللوحة لساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضن مع الروابط، قم بغسل اللوحة ثلاث مرات بمحلول الغسل. ثم، قم بضخ 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأساسية للماوس أحادية النسيلة المضادة للهيستو-تاجز في كل بئر وحضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لساعتين.

بعد غسل الأجسام المضادة، قم بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المقترن بالـ HRP ضد الغلوبولين المناعي G للماوس إلى كل بئر. لف اللوحة بورق الألمنيوم لتجنب الضوء. ثم، قم بحضن اللوحة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

استخدم تقنية الغسل القياسية لإزالة الجسم المضاد الثانوي. الآن، قم بإضافة 100 ميكرولتر من TMB الطازج المحضر من كميات متساوية من محاليل الركيزة المخزنة A وB إلى كل بئر. ثم، قم بإبقاء اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ثم، بعد تطور اللون الكافي، قم بإضافة 50 ميكرولتر من المحلول المخزن إلى كل بئر.

يستند البروتوكول إلى الافتراض أن الإشارة المرسلة تنشأ من الربط المحدد. قد يكون من الضروري تقدير مساهمة الربط غير المحدد في الإشارة. ثم، قم بقراءة قيم امتصاص اللوحة عند 450 نانومتر وتابع بحساب قيمة KD.

تتبع إجراء LRA التنافسي نفس الخطوات التي تتبع في إجراء LRA المباشر، باستثناء بعض التغييرات المهمة. بعد غسل الروابط الزائدة المغلفة على اللوحة، قم بحجب آبار اللوحة. أضف 200 ميكرولتر من محلول 5٪ BSA إلى كل بئر وحضن اللوحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

خلال الحضن، قم بتحضير الروابط المؤتلفة المميزة بالهيستو-تاجز بتركيز ثابت يبلغ 10 نانوغرام لكل ملليلتر في PBS. ثم، قم بتحضير الببتيد المثبط بتركيزات مختلفة في PBS، تتراوح من 10 نانومولار إلى 100 ميكرومولار لضمان منحنى الجرعة-الاستجابة. وبالتالي، يمكن العثور على قيمة IC50 للببتيد المثبط.

في آبار التحكم، قم بتحميل تركيز الرابط الثابت بدون الببتيد لاشتقاق الربط الأقصى. في الآبار الفارغة، قم بإضافة PBS فقط بدون رابط أو ببتيد. في الآبار الأخرى، قم بإضافة 50 ميكرولتر من الروابط و50 ميكرولتر من كل تركيز للببتيد.

ثم، قم بحضن اللوحة لساعتين في درجة حرارة الغرفة وتابع كالمعتاد. تم تحديد ثابت التفكك بين ثلاث جزيئات مختلفة من رابطات الإنترفيرون والوحدة الفرعية ألفا لمستقبل IL28R-a باستخدام LRA المباشر، ورسم منحنى الربط المكتمل مقابل لوغاريتم تركيز الإنترفيرون المقابل. توضح هذه النتائج منحنى ربط يمكن تحليله لتقدير قيمة KD عن طريق ملاءمة البيانات إلى معادلة Hill.

يوضح مخطط Scatchard التعاون في ربط الرابط، وأخيراً فإن رابط الإنترفيرون 1 لديه أعلى قدرة على الارتباط، يليه رابط الإنترفيرون 2 ورابط الإنترفيرون 3. تشير قيمة معامل Hill إلى أكثر من 1 إلى زيادة الارتباط لروابط إضافية بعد التفاعل الأولي بين الرابط والمستقبل. بعد ذلك، تم استخدام LRA التنافسي لتحديد تأثير الببتيد المثبط على التفاعل بين جزيئات رابطات الإنترفيرون والوحدة الفرعية للمستقبل.

يتم رسم قيمة الربط المكتمل لجزيء رابط إنترفيرون عند 10 نانوغرام لكل ملليلتر مقابل لوغاريتم تركيز جزيء الببتيد الإنترفيرون. من هذه البيانات، تم تقدير قيم IC50. وفقاً للقيم المحسوبة، حجب الببتيد المثبط التفاعل بين جزيء رابط الإنترفيرون 3 وIL28R-a إلى أكبر مدى.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في ثماني ساعات. إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن كل تركيز إشباع لارتباط الرابط-المستقبل، بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء الطرق الأخرى للحصول على قيم KD أكثر تفصيلاً.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تفاعلات الرابط-المستقبل لاستكشاف المواد المثبطة لمنع هذه التفاعلات.