احتياطات السلامة وإجراءات التشغيل في (A) مختبر BSL-4: 2. الممارسات العامة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الممارسات الآمنة عند العمل في مختبر بدلة المستوى الرابع من السلامة البيولوجية باستخدام مقايسة اللويحات كمثال. يوضح هذا الإجراء التعديلات اللازمة لإجراء مقايسة لويحات قياسية في بيئة المستوى الرابع من السلامة البيولوجية. ستقوم Tracey Burdette، وهي فنية من مرفق الأبحاث المتكامل، بتوضيح الإجراء معي.

بعد إكمال قائمة التحقق اليومية للأنظمة الداخلية، قم بتنظيف كبينة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية (class II biological safety cabinet) عن طريق رش الجزء الداخلي، بما في ذلك النافذة الزجاجية (sash)، بمحلول مطهر من الأمونيوم الرباعي المزدوج بتركيز 5%. بعد ذلك، امسح الكبينة باستخدام مناشف ورقية، مع التأكد من ترك زجاجة الرش التي تحتوي على المحلول المطهر داخل الكبينة لرش اليدين المرتديتين للقفازات أثناء وبعد إكمال المقايسة. رش محلول إيثانول بتركيز 70% داخل الكبينة وعلى النافذة الزجاجية لإزالة بقايا المحلول المطهر اللزجة.

قم بتجهيز حاوية نفايات لكابينة السلامة البيولوجية. تأكد من أن التركيز النهائي لمحلول مطهر الأمونيوم الرباعي المزدوج في حاوية النفايات لا يقل عن 5% مع مراعاة أي سائل إضافي يتم إضافته. ضع حاوية النفايات التي تحتوي على محلول مطهر الأمونيوم الرباعي المزدوج بتركيز 5% داخل كابينة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

يجب تنفيذ جميع الأعمال في أقرب نقطة ممكنة من المركز الداخلي لكابينة السلامة الحيوية من الفئة الثانية (class II biosafety cabinet)، حيث تم تصميم المركز الداخلي ليكون الموضع الأكثر فعالية لحماية الباحث. اسحب 50 µL من عينة الفيروس والفيروس الضابط، وضعها في 450 µL من وسط Dulbecco's Modified Eagle's المضاف إليه 2% fetal bovine serum في آبار التخفيف.

استمر في إجراء التخفيفات المتسلسلة حسب الحاجة. اخلط عينات الفيروس خمس مرات على الأقل باستخدام طرف الماصة مع تغيير الأطراف بعد كل عملية تخفيف. اخلط ببطء لتقليل تكوين فقاعات الهواء في العينات.

عند الانتهاء، ضع آبار التخفيف جانباً. وعند التخلص من الرؤوس، اشطف كل رأس بمحلول مطهر من دلو النفايات لتطهير الجزء الداخلي والخارجي من الرأس قبل طرحه في دلو النفايات. قم بإزالة معظم الوسط من آبار أطباق زراعة الخلايا ذات الستة آبار.

أضف 100 µL من العينة الصحيحة في البئر المناسب من الأطباق المجهزة مسبقاً بملصقات تعريفية، وذلك في مكررات ثنائية. عند الانتهاء، قم برش اليدين المرتدية للقفازات بمحلول التطهير. استخدم منشفة ورقية مبللة بمحلول التطهير لمسح الجزء الخارجي من جميع الأطباق قبل وضع الأطباق يدوياً في الحاضنة.

قم بهز الأطباق بحركة على شكل رقم 8 لضمان انتشار العينة بشكل صحيح فوق الخلايا كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة. أضف 2 mL من خليط التغطية إلى كل بئر وقم بالهز مرة أخرى بحركة على شكل رقم 8 لضمان توزيع التغطية بالتساوي عبر سطح البئر. اغمر جميع المواد العادمة تماماً في محلول مطهر بتركيز 5% في وعاء النفايات لمدة تلامس لا تقل عن 10 دقائق.

قم برش الجزء الداخلي والخارجي لدلو النفايات، والجزء الداخلي من كابينة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية، والأسطح الخارجية للمعدات، واليدين المغلفتين بالقفازات باستخدام محلول مطهر بتركيز 5%. اترك المحلول في دلو النفايات وعلى الأسطح الأخرى لمدة تلامس تبلغ 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإخراج العناصر من كابينة السلامة البيولوجية ونقلها إلى الحوض.

ضع الماصة المستخدمة في صينية الماصات لتعقيمها بالبخار (autoclaving). صُب محتويات دلو النفايات في مصفاة في الحوض. بعد ذلك، أحضر حاوية نفايات المواد الخطرة البيولوجية المبطنة بكيس أحمر مخصص للمواد الخطرة البيولوجية إلى الحوض، وأفرغ محتويات المصفاة في الكيس الأحمر.

ضع كيس المخلفات البيولوجية الخطرة على صينية جهاز التعقيم (autoclave) الموجودة على عربة. أغلق أكياس التعقيم بشكل فضفاض باستخدام الشريط اللاصق للسماح للبخار بالدخول إلى الكيس. ثم ضع على أحد أشرطة التعقيم الأحرف الأولى من اسمك والتاريخ.

أخرج القضيب المعدني المثقوب من الموصدة (autoclave) وافتح الغطاء العلوي. ضع أمبولة مؤشر حيوي تحتوي على أبواغ من *Geobacillus stearothermophilus* داخل القضيب المعدني لتعمل كاختبار للتأكد من اكتمال دورة التعقيم في الموصدة بنجاح. ضع صينية الموصدة المليئة بالنفايات داخل الموصدة.

قم بتشغيل جهاز التعقيم (autoclave) وتحقق من بدء الدورة. ستوضح شاشة التشغيل الخاصة بجهاز التعقيم الوقت المتبقي لتلك الدورة. بعد اكتمال فترة الحضانة المطلوبة، أخرج أطباق مقايسة اللويحات (plaque assay plates) بعناية من الحاضنة وضعها يدوياً داخل كابينة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية (class II biosafety cabinet) النظيفة.

قم بشفط الوسط والمادة المغطية باستخدام ماصة وتفريغهما في حاوية محلول التطهير. استبدل الوسط بخليط من 10% neutral buffered formalin و 0.8% crystal violet لتعطيل الفيروس لمدة تلامس تبلغ 30 دقيقة. بعد التعطيل، قم بإزالة خليط neutral buffered formalin/crystal violet بعناية ووضعه في حاوية نفايات منفصلة لمعادلته قبل التخلص منه.

عند الحوض، اشطف الأطباق لإزالة الصبغة الزائدة، ثم ضع الأطباق في صينية لتجف تماماً. استخدم صندوق إضاءة لعد اللويحات. سجل جميع النتائج، واحسب عيارات الفيروس من المعادلة القياسية.

لإخراج العينات المثبطة من مختبر المستوى الرابع من السلامة البيولوجية (BSL-4)، ضع الأنابيب أو الأطباق في كيس إغلاق حراري. قم برش الجزء الداخلي من الكيس بمحلول مطهر أو محلول تثبيت بتركيز 5%، وذلك لتطهير الجزء الداخلي من الكيس والجزء الخارجي من أنابيب العينات. بعد ذلك، قم بإغلاق الكيس حرارياً.

ضع هذا الكيس داخل كيس آخر باتباع الإجراء نفسه. قم بإغلاق الكيس الثاني باللحام الحراري وضع الأكياس مزدوجة الإغلاق في خزان غمر يحتوي على محلول مطهر بتركيز 5% لمدة 10 دقائق على الأقل، وذلك لتطهير السطح الخارجي للأكياس. قم بتعبئة سجل خزان الغمر داخل المختبر من خلال تحديد عدد وحجم الأنابيب، والحجم الموجود في الأنابيب، والعامل المستخدم، وطريقة التعطيل المستخدمة، والغرفة التي سيتم نقل العينات إليها.

يُعد اتباع الإجراءات السليمة داخل مختبر المستوى الرابع من السلامة البيولوجية أمرًا بالغ الأهمية لضمان إتمام المقايسات بشكل آمن وفعال. ومن خلال الرجوع إلى قائمة المراجعة الداخلية اليومية المكتملة، يضمن موظفو المختبر أن المعدات تعمل بكامل كفاءتها. يتم تخفيف عينة الفيروس تسلسلياً للحصول على أطباق تحتوي على 30 إلى 300 لويحة (plaque) لكل بئر ولتحديد عيار الفيروس.

تؤثر عدة عوامل على تكوين اللويحات، بما في ذلك توجه الفيروس نحو الخطوط الخلوية المضيفة، وتقنية التلقيح، وظروف نمو الفيروس، ونطاق التخفيف المناسب، واختيار الطبقة المغطية. يتم تطهير النفايات المتولدة في كابينة السلامة البيولوجية أثناء الإجراء مرتين، حيث يتم تطهير النفايات بشكل صحيح مرة واحدة قبل إخراجها من كابينة السلامة البيولوجية.

بعد ذلك، يتم تعقيم النفايات بجهاز التعقيم البخاري (autoclaved) قبل إخراجها من بيئة المستوى الرابع للسلامة البيولوجية للحيوانات. ومن خلال اتباع هذه الإجراءات، لم يتم تسجيل أي إصابات مكتسبة من المختبر أثناء أبحاث المستوى الرابع للسلامة البيولوجية للحيوانات في مرفق الأبحاث المتكامل في فريدريك. يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات اعتماداً على عدد العينات إذا تم تنفيذ التقنية بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، تذكر إجراء التخفيفات بشكل صحيح وعدّ اللويحات وفقاً لذلك، والالتزام بجميع احتياطات السلامة، لضمان تجربة آمنة وناجحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد للقيود الفيزيائية التي تفرضها بدلات الضغط الإيجابي، والوقت الإضافي المطلوب لإكمال مقايسة اللويحات القياسية.