متعددة اكسون تخطي عن طريق أليغنوكليوتيد] كوكتيل العقاقير في ضمور العضلات المرتبطة X الناب

الهدف العام من هذه التجربة هو فحص فعالية وسمية تخطي الإكسون المتعدد باستخدام قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى أو AONs في نموذج من ضمور العضلات الدوشيني أو DMD. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في البحث الانتقالي لعلاج تخطي exon antisense ، مثل ما إذا كانت قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى يمكن أن تحفز تخطي الإكسون المتعدد وتدمر تعبير الحثل في نموذج حيواني كبير. الميزة الرئيسية لاستخدام نموذج في دراسة هي أن النتائج العلاجية في الكبيرة يمكن استقراءها بشكل أكثر موثوقية لمرضى DMD.

على الرغم من أن تخطي exon هو علاج واعد جدا لمرض دوشون ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على الأمراض الوراثية الأخرى ، مثل الحثل العضلي الخلقي وضمور العضلات في حزام الأطراف. سيتم عرض التجارب في المختبر من قبل الدكتور يوشيتسوغو أوكي ، رئيس المختبر لدينا ، وسيتم توضيح التجارب في الجسم الحي من قبل الدكتور موتسوكي كوراوكا ، زميل ما بعد الدكتوراه مع قسم أمامي. بعد تصميم AONs وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ألواح 6 آبار لزرع واحد إلى خمسة أضعاف 10 إلى ثالث لكل سنتيمتر مربع من الخلايا العضلية CXMD في ثلاثة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ pen-sterbe.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى 60 إلى 80٪ ملتقية. عندما تصل الخلايا إلى التقاء المطلوب ، استخدم وسط المصل المخفض لتخفيف كاشف تعداء الجسيم الشحمي الكاتيوني إلى حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر ، واترك الخليط يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد ذلك ، باستخدام وسط مصل منخفض ، قم بتخفيف AONs إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.

امزج كاشف التعداء المخفف مع AONs المخففة ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بإزالة الوسيط من الخلايا واستخدم وسيطا جديدا لغسل الخلايا ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف 0.8 مل من الوسط إلى خليط التعداء ، ثم أضف المحلول بالكامل إلى الخلايا المغسولة حديثا.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، أضف وسيط التمايز ، أو DM ، إلى الخلايا ، واحتضن لمدة تصل إلى 10 أيام حتى يحدث التمايز. بدءا من اليوم الثالث تقريبا ، تحقق من التمايز.

لإجراء تعداء مورفولينو للأرومات العضلية للكلاب ، قم بزراعة الخلايا العضلية CXMD كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. سخني كوكتيل مورفولينوس على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أضف كاشف توصيل الببتيد واضبط المورفولينو على تركيز نهائي من ثلاثة إلى ستة ميكرومولار.

بعد ذلك ، استخدم DM لاستبدال الوسط في الخلايا العضلية ، وأضف المورفولينو إلى كل بئر بتركيز نهائي من ميكرومولار واحد. احتضن لمدة 16 إلى 18 ساعة. بعد ذلك ، لجمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي ، أضف ملليلترا واحدا من غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول كلوروفورم إلى الخلايا لفصلها عن اللوحة.

بعد احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، انقل الخلايا إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين حتى يمكن رؤية ثلاث طبقات منفصلة ، طبقة الحمض النووي الريبي ، وطبقة البروتين ، وطبقة الحمض النووي. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 12،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم قم بإزالة الطبقة العليا من المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب يحتوي على 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول. قم بتدوير الأنابيب الطافية قبل إزالة المادة الطافية وحفظ حبيبات الحمض النووي الريبي. استخدم الإيثانول لغسل الحبيبات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

اقلب الأنبوب لمدة 15 دقيقة لتبخر الإيثانول المتبقي قبل إضافة 15 إلى 30 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase. بعد ذلك ، استخدم التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر لتحديد كمية الحمض النووي الريبي. لإجراء RT-PCR ، امزج الكواشف التالية معا وأضف الماء إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولترا.

ضع العينات في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج التالي. عند اكتمال التشغيل ، قم بتخزين المنتج عند أربع درجات مئوية أو 20 درجة مئوية. لإجراء الحقن العضلي ، بعد تحضير للجراحة وتخديره وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مشرطا لقطع الجلد حوالي خمسة سنتيمترات طوليا فوق الظنبوب القحفي ، أو CT.To تحديد مواقع الحقن ، استخدم إبرة جراحية وخيط جراحي لخياطة اللفافة العميقة عن طريق عمل علامتين غرزة على فترات سنتيمترين.

من المهم جدا تحديد موقع الحقن بخيط لأن هذا يسمح بخزعة أكثر دقة. بعد ذلك ، باستخدام إبرة قياس 27 ، قم بحقن التركيز المطلوب من AONs في العضلات ، واترك الإبرة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، لإجراء خزعة عضلية مفتوحة ، استخدم مشرطا جراحيا لإزالة قطعة من الأنسجة العضلية يبلغ طولها حوالي سنتيمترين من عضلة التصوير المقطعي المحوسب.

ضع اللفافة العضلية مرة أخرى فوق العضلات واستخدم خيطا قابلا للامتصاص 000 لإغلاق الأنسجة. ثم استخدم 000 خيط نايلون لإغلاق الجلد. باستخدام إبرة، قم بإعطاء حقنة عضلية بمقدار 0.02 ملليغرام لكل كيلوغرام من هيدروكلوريد البوبرينورفين.

لحقن كوكتيل يحتوي على كميات متساوية من كل AON في وريد أحد الأطراف ، أثناء إمساك وفقا لبروتوكول النص ، أدخل إبرة وريدية في وريد الأطراف. باستخدام مضخة التسريب أو مشغل الحقنة ، قم بحقن 50 مل إجمالا بمعدل 2.5 مل في الدقيقة لمدة 20 دقيقة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. كرر الحقن أسبوعيا أو كل أسبوعين ، حيث سيتراكم تعبير الديستروفين مع الحقن المتكرر.

لإجراء اختبارات الدم الأسبوعية لفحص السمية ، استخدم إبرة لجمع ثلاثة ملليلتر من الدم من أحد الأوردة تحت الجلد في الطرف الأمامي أو الخلفي. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قم بتضمين التقييمات التالية. إجراء المزيد من التحليلات وفقا لبروتوكول النص.

تم نقل الأرومات العضلية بظروف معالجة مختلفة 2'OMePS من أجل مقارنة فعالية كل AON. يمثل الجل الموضح هنا عينات RT-PCR من الحمض النووي الريبي الذي تم جمعه بعد أربعة أيام من العلاج. تمثل العصابات الأعلى على الجل منتجات DMD خارج الإطار ، وقد شوهدت في الأرومات العضلية المعالجة غير المعالجة Ex8A و Ex8B.

أظهرت Ex6A و Ex6B و Ex8A والأرومات العضلية المعالجة بالكوكتيل منتجات في الإطار. تحقق تسلسل (كدنا) من تخطي Exon 6 إلى 9. كما هو موضح في هذا الشكل ، كشفت الكيمياء المناعية أن خلايا المعالجة ب AON قد زادت من الألياف الإيجابية للديستروفين مقارنة بالعينات غير المعالجة.

لمقارنة فعالية حالات العلاج المختلفة AON ، تم حقن CXMD ب Ex6A ، أو مزيج من Ex6A و Ex6B و Ex8A بجرعات مختلفة. تظهر عينات العضلات الملطخة ل DYS1 زيادة في تعبير الديستروفين في العينات المعالجة بالكوكتيلات ، وزادت الألياف الإيجابية للديستروفين مع جرعة الديستروفين. بعد الحقن الجهازية ، أظهرت CXMD المعالجة بالكوكتيل زيادة في تعبير الديستروفين مقارنة بكلاب NT CXMD ، سواء في عينات التصوير المقطعي المحوسب أو عضلات القلب.

ومع ذلك ، أظهرت عضلات الهيكل العظمي المعالجة ب AON تعبيرا أعلى بكثير عن الديستروفين مقارنة بعضلة القلب المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت CXMD المعالجة تحسنا في علم الأنسجة المرضي مع انخفاض كبير في الألياف ذات النواة المركزية مقارنة بكلاب NT CXMD. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء كل من التجارب في المختبر وفي الجسم الحي في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراقبة الحالة الصحية للكلب بعناية. بعد تطويره ، مهد تخطي exon الجهازي الطريق للباحثين في هذا المجال لبدء التجارب السريرية البشرية على مرضى DMD. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية علاج باستخدام قليل النوكليوتيدات المضادة للحساس.