الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

الهدف العام من إجراء الاستنساخ والتحويل هذا هو توليد نواقل كريسبر بكفاءة والقضاء على جذور الطماطم الطافرة التي يمكن استخدامها في الدراسات الجينومية الوظيفية. هذه الطريقة هي أداة مفيدة في مجال علم الجينوم النباتي لأنها يمكن أن تولد عددا كبيرا من المسوخ بالضربة القاضية التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من عمليات الجذر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنجاز إجراء الاستنساخ في خطوة واحدة ، مما يعزز أنه يمكن الحصول على مواد المجموعة في غضون أسابيع فقط.

أولا ، قم بتوجيه تصميم الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي oligos ليشمل جزء GN19 من الزخارف المستهدفة المحاطة بخمسة تسلسلات أولية وثلاثة أولية 20 نيوكليوتيدات مطلوبة لتجميع الحمض النووي. هضم من واحد إلى خمسة ميكروغرامات من بلازميد الكازين P201N مع إنزيم التقييد Spe1 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تنقية العمود الملخص وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، أعد تعليقه في 15 ميكرولتر من 10 ملليمولار Trs HCL.

تحديد كمية الحمض النووي عن طريق القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. قم بإجراء هضم ثان باستخدام إنزيم التقييد Swa1 عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين. تحقق من 100 إلى 200 نانوجرام على صفر نقطة ثمانية بالمائة من هلام الاغاروز لتأكيد الهضم الكامل.

سيكون للبلازميد المهضوم بشكل صحيح نطاق واحد عند 14،313 زوجا أساسيا. لتضخيم PCR ، استخدم ستة محفزات وسقالات الحمض النووي من البلازميد المكوكي gRNA القرص. استخدم التمهيدي Swa1 و Mtu6F و MTU6R ، والسقالة F في سقالة Spe1 R ، في بوليميراز عالي الدقة.

تصور ثلاثة ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز بنسبة واحد بالمائة لتأكيد التضخيم. يتكون أمبليكون MTU6 من 377 زوجا أساسيا ، وأمبليكون السقالة هو 106 زوجا أساسيا. قم بتنقية منتجات PCR المتبقية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بالقياس الكمي عن طريق قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية كما كان من قبل وقم بتخزينه عند سالب 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، أعد تعليق الأنبوب بالكامل من gRNA oligos إلى 100 ميكرومولار في ماء من الدرجة المختبرية. أضف ميكرولتر واحد من oligos إلى 500 ميكرولتر من 1xNEB مخزن مؤقت نقطتين واحد واخلطه جيدا.

قم ببرمجة جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن لتثبيته عند 50 درجة مئوية. اجمع بين 100 نانوجرام من المتجه الخطي ، و 50 نانوغراما من محفز MtU6 ، و 12 نانوغراما من السقالة ، وميكرولتر واحد من gRNA oligo المخفف في الماء إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات. أضف خمسة ميكرولترات من 2X عالية الدقة DNA Assembly Mastermix.

تخلط جيدا وتدور. احتضان التفاعل لمدة 60 دقيقة في المدورة الحرارية 50 درجة مئوية. بعد الساعة عند 50 درجة مئوية ، ضع التفاعل على الجليد ثم استخدم ميكرولترين لتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة باستخدام التقنيات القياسية.

لوحة التحول على LB Agar مكملة ب 50 ملليغرام لكل مليلتر كاناميسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بفحص المستعمرات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام التمهيدي StUb3p 218R و 1Sce1R. قم بتخفيف أليكوات من تفاعل تجميع الحمض النووي المتبقي بالماء من واحد إلى خمسة ، واستخدم ميكرولتر واحد كعنصر تحكم إيجابي لشاشة المستعمرة.

قم أيضا بتضمين نانوغرام واحد من بلازميد الكازين الدائري P201N كعنصر تحكم بدون إدخال. بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المعلمات الموجودة في الجزء المكتوب من البروتوكول ، تصور منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز بنسبة واحد بالمائة. تحتوي الإدخالات الصحيحة على 725 زوجا أساسيا نطاقا والمتجهات التي لا تحتوي على إدخالات على نطاق زوج أساسي 310.

تنمو مستعمرات إيجابية في المزارع السائلة LB Can50 بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتنقية البلازميدات باستخدام مجموعة تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد تسلسل Sanger للبلازميدات المنقاة باستخدام التمهيدي StuB3P218R ، قم بمحاذاة الكروماتوغرامات مع مروج MtU6 ، والهدف ، وتسلسلات السقالة لضمان عدم إدخال أي أخطاء أثناء الاستنساخ.

قم بإجراء هضم تشخيصي عن طريق هضم ميكروغرام واحد من البلازميد باستخدام EcoR5 و Sti1. عند تصورها على جل الاغاروز من نقطة صفر ثمانية ، يجب رؤية طقطقة النطاقات هذه. أخيرا ، قم بتحويل البلازميدات إلى سلالة Agrobacterium rhizogenes ARqua1 عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من إعداد البلازميد إلى 50 ميكرولترا من الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية والتغذية الكهربائية في كوفيت ميلبيد واحد.

أضف ما يقرب من 500 ميكرولتر من SOC Media ورجه على حرارة 28 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم ضع على ألواح LB Can50 وتنمو عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. ابدأ هذا القسم من الإجراء بتعقيم بذور الطماطم في مبيض منزلي بنسبة 20 في المائة لمدة 15 دقيقة مع الخلط المستمر.

ثم انقل البذور إلى غطاء تدفق رقائقي. قم بإزالة المبيض واغسله بماء مختبري معقم ثلاث مرات. طبق 30 بذرة في صندوق GA7 يحتوي على نصف MS Media.

اتركيه لينبت لمدة يومين تقريبا في الظلام. بمجرد أن تنبت البذور ، انقل صناديق GA7 إلى الضوء في اليوم السابق للتحول ، قم بإخراج مزارع A.rhizogenes على LB الصلب الذي يحتوي على Can50 وتنمو عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في يوم التحول ، اعمل في غطاء التدفق الصفحي لإضافة 25 ميكرولترا من Acetosyringone إلى 50 ملليلترا من نصف MS وصب ستة ملليلتر في كل أنبوب ثقافة.

استخدم طرفا منحنيا سعة 200 ميكرولتر لكشط خلايا A.rhizogenes من اللوحة وإعادة تعليقها في ستة ملليلتر من نصف سائل MS. دوامة الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا تماما. بعد إعادة تعليق الخلايا من كل ناقل ، خذ ملليلتر واحدا من الخلايا وقم بقياس الكثافة الضوئية بطول موجي ثابت يبلغ 600 نانومتر.

أضف ملليلترين من نصف سائل MS إلى طبق بتري بورق ترشيح معقم. استئصال الفلقات من الشتلات وضعها على ورق الترشيح المبلل. بمجرد جمع جميع الفلقات ، قم بقطع سنتيمتر واحد بعيدا عن الفلقات ، مما ينتج عنه قطع فلقة ذات طرفين مقطوعين.

أضف النباتات السابقة إلى محاليل A.rhizogenes واخلطها. احتضن لمدة 20 دقيقة مع التقليب العرضي. أثناء حضانة A.rhizogenes ، أضف قطعة من ورق الترشيح إلى طبق بتري لكل تحويل بناء.

أيضا ، ضع نصف وسائط صلبة من MS بدون مضادات حيوية في غطاء التدفق الصفحي حتى يجف. استخدم ملقطا معقما لإخراج الفلقات من محلول A.rhizogenes وضعها على ورق ترشيح جاف. قم بتغطيتها بغطاء طبق بتري لضمان عدم جفاف الأنسجة أثناء المتابعة إلى التحول التالي.

بعد ذلك ، قم بمسح الفلقات على ورق الترشيح ونقل الجانب المحوري حتى نصف وسائط MS. لف الألواح بشريط جراحي وشارك في الزراعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين. بعد الزراعة المشتركة ، قم بنقل الجانب البطني للفلقات إلى نصف وسط MS مكمل.

لف بشريط جراحي. حافظ على الثقافات تحت أضواء الفلورسنت في درجة حرارة الغرفة مع فترة تصوير مدتها 16 ساعة. بعد نقطة واحدة من خمسة إلى أسبوعين ، استخدم ملقطا معقما ومشرطا لاستئصال الجذور التي لا يقل طولها عن سنتيمترين من الفلقات ونقلها إلى Ticarcillon / Clavulanate Acid و Kanamycin المكمل نصف وسائط MS.

انقل عشرة إلى 15 جذرا إلى طبق واحد. ضع علامة على موضع أطراف الجذر بعلامة. لفها بشريط جراحي وحفظها في غرفة الثقافة.

بعد أسبوع واحد ، ترى جذور التحويل تنمو على الوسائط الانتقائية. حصاد عينة فرعية من الجذور المحولة لاستخراج الحمض النووي باستخدام طريقة استخراج الحمض النووي المفضلة. يمكن رؤية الجذور المشعرة وهي تخرج من النبتات بعد 11 يوما من التحول.

يتم اختيار الجذور على Ticarcillon / Clavulanate Acid و Kanamycin مكمل نصف MS Media لمدة أسبوع تقريبا. تشير القضبان الرمادية إلى موضع أطراف الجذر في وقت الطلاء. هذا مثال على استنساخ وتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد طفرات الحمض النووي مع هدفين جينيين مختلفين في أربعة أحداث جذرية مشعرة مختلفة.

المربع الرمادي إلى التسلسل المستهدف GN20 GG ويشير دلتا إلى نوع الطفرة. يظهر عدد المستنسخة ذات الطفرة المشار إليها على اليمين. هذا مثال على هلام بولي أكريلاميد لتحديد طفرات الحمض النووي.

تشير عمليات الحذف الكبيرة والنطاقات غير المتجانسة إلى وجود طفرات في الحمض النووي في التسلسلات المستهدفة. تم تسجيل ستة من 12 حدثا مستقلا على أنها متحولات كما هو موضح في رمز دلتا. يشير WT إلى عنصر التحكم في النوع البري و NT إلى عنصر تحكم لا يوجد قالب.

بمجرد إتقانها ، يمكن إنتاج عشرات إلى مئات من نواقل كريسبر في أسبوع واحد ويمكن الحصول على مواد المجموعة الاتجاهية في غضون أسابيع. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إزالة ومنع نمو أي بكتيريا Agrobacterium متبقية. فرط نمو Agrobacterium سوف يثبط ويقتل أي مادة جذرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء متجهات CRISPR باستخدام تجميع الحمض النووي ، وكيفية اختبار تلك النواقل باستخدام نظام نموذج الجذر المشعر والطماطم.