LC-MS تحليل الصفائح الدموية البشرية باعتبارها منصة لدراسة الميتوكوندريا الأيض
أبريل 4, 2016
نحن هنا تظهر الصفائح الدموية البشرية معزولة يمكن استخدامها بوصفها الوصول فيفو السابقين نموذج لدراسة التعديلات التمثيل الغذائي ردا على مجمع أنا المانع روتينون. هذا النهج يعمل تتبع النظائر وتقدير نسبي من قبل السائل الطيف اللوني الشامل ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من التصاميم الدراسة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد كيفية تغيير العلاج الغريب الحيوي أو الحالة المرضية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. هذه الطريقة لديها القدرة على الكشف عن كيفية تأثير حالة المرض أو السم المطبق على التمثيل الغذائي الخلوي. وبمجرد معرفة ذلك ، فإن طريقتنا لديها القدرة على الكشف عما إذا كان نوع من التدخل يمكن أن يصحح العيب.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تعتمد على خطوط الخلايا المحولة ، لذلك من المرجح أن تقدم إجابات ذات صلة مباشرة بصحة الإنسان. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول مخزون 10 ملليمولار من الروتينون في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. قم بإجراء تخفيف تسلسلي لمحلول مخزون الروتينون 10 ملليمولار للحصول على محاليل بتركيزات روتينون تتراوح من نانومولار واحد إلى 100 ميكرومولار.
بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من كل محلول مخزون إلى خمسة ملليلتر من محلول عازلة Tyrode المخصب المعد مسبقا لتحضير محاليل بتركيزات روتينون تتراوح من 10 بيكومولار إلى ميكرومولار واحدة. أضف 50 ميكرولترا من DMSO إلى إحدى عينات المحلول العازل لتكون بمثابة تحكم في السيارة. لعزل الصفائح الدموية من الدم الكامل ، قم بالطرد المركزي عينات الدم الكامل عند 175 × جم لمدة 15 دقيقة دون انقطاع.
عند الانتهاء ، انقل ملليلتر واحد من طبقة البلازما العليا الغنية بالصفائح الدموية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. عند نقل البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، احرص على عدم إزعاج الطبقة المصفرة حتى لا تتلوث حبيبات الصفائح الدموية بالخلايا الليمفاوية. الطرد المركزي لطبقة البلازما الغنية بالصفائح الدموية عند 400 × جم لمدة خمس دقائق.
ثم ، استنشق supernatent. باستخدام ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات بيولوجية لكل حالة ، قم بإعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية في مليلتر واحد من كل محلول روتينون معد مسبقا. بعد ذلك ، قم باحتضان الصفائح الدموية المعلقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المغلفة بالماء على رطوبة 95٪ و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
في هذه المرحلة ، قم بتكسير الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي للعينات عند 3000 × جم لمدة ثلاث دقائق. بعد شفط السوبر ، أضف المعيار الداخلي المستقر المناسب المسمى بالنظائر الثابتة. بعد ذلك ، أعد تعليق الصفائح الدموية في 750 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المثلج 10٪.
نبض صوتنة كل عينة 30 مرة مع نبضات 0.5 ثانية. بعد الطرد المركزي ، قم بلصق أعمدة استخراج الطور الصلب C18 على مشعب الفراغ. قم بتكييف الأعمدة بملليلتر واحد من الميثانول.
ثم قم بموازنة الأعمدة بملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج. قم بتشغيل المادة الطافية المشتقة من العينة من خلال الأعمدة. عند الانتهاء ، اغسل الأعمدة بملليلتر واحد من الماء.
بعد ذلك ، قم بتحميل أنابيب الطرد المركزي الزجاجية سعة 10 مليلتر في مشعب الفراغ لجمع كسور الشطف. قم بتقطيع الأعمدة بمليلتر واحد من أسيتات الأمونيوم 25 ملليمولار والميثانول. بعد تجفيف المصفف تحت غاز النيتروجين ، قم بتعليق المخلفات المجففة في 50 ميكرولتر من حمض 5٪ 5-sulfosalicyclic ونقل العينات إلى ملفات HPLC لتحليلها.
كما ورد سابقا في خلايا SH-SY5Y ، يفترض أن التغيرات في المستويات النسبية لثيواسترات الأسيل CoA استجابة للروتينون ناتجة عن تثبيط المركب. على وجه التحديد ، هناك انخفاض يعتمد على الجرعة في Succinyl CoA مع زيادة متزامنة في بيتا هيدروكسي بوتيريل CoA ، بينما لم تتغير مستويات أسيتيل CoA. يكشف تحليل الصفائح الدموية البشرية المعالجة بالروتينون عن نتائج متسقة للغاية ويوفر مجموعة فريدة من البيانات التجريبية.
من المهم ملاحظة أن هذه الملاحظة تؤكد اعتماد الميتوكوندريا للاستجابة للروتينون لأن الصفائح الدموية تفتقر إلى النوى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تتبع التمثيل الغذائي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل: كيف يؤثر هذا العلاج أو حالة المرض على استخدام الركيزة؟ إذا حددنا التغيرات في مستويات بعض المستقلب ، فلماذا يتغير؟
ما هي الخطوات التي تتأثر في المسار وبأي طريقة؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الصفائح الدموية من الدم الكامل ، وإجراء تحدي خارج الجسم الحي الذي يتم التحكم فيه واستخراج ثيويسترات أسيل CoA لتحليل LCMS.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة استخدام الصفائح الدموية البشرية المعزولة كنموذج خارج الجسم (ex vivo) لاستقصاء التكيفات الأيضية استجابةً لمثبط المعقد I، روتنون (rotenone). تعتمد هذه الطريقة على التتبع النظائري وكروماتوغرافيا السوائل مع قياس الطيف الكتلي للتقدير الكمي النسبي، مما يجعلها قابلة للتطبيق في تصاميم دراسات متنوعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التمثيل الغذائي الخلوي
- علم الأدوية
- الأهمية بالنسبة لصحة الإنسان
خلفية علمية
- يُعد فهم كيفية تأثير المواد الغريبة الحيوية (xenobiotics) على التمثيل الغذائي الخلوي أمراً بالغ الأهمية.
- توفر الصفائح الدموية البشرية المعزولة نموذجاً ملائماً مقارنةً بخطوط الخلايا المحولة.
- يمكن أن يساعد هذا النهج في تحديد التدخلات المحتملة للعيوب الأيضية.
- يُستخدم الروتينون كمثبط للمعقد I لدراسة التغيرات الأيضية.
الغرض من الدراسة
- تحديد تأثيرات العلاج بالمركبات الغريبة (xenobiotics) على التمثيل الغذائي الخلوي.
- استكشاف كيف تؤدي الحالات المرضية إلى تغيير العمليات التمثيلية.
- تقييم قدرة التدخلات العلاجية على تصحيح العيوب التمثيلية.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول مخزون بتركيز 10 millimolar من الروتينون في dimethyl sulfoxide.
- التخفيف التسلسلي للمحلول المخزون من الروتينون للحصول على تركيزات متنوعة.
- التتبع النظائري للتحليل الأيضي.
- استخدام الكروماتوغرافيا السائلة الملحقة بمطياف الكتلة للتقدير الكمي.
النتائج الرئيسية
- تمثل الصفائح الدموية المعزولة الاستجابات الأيضية للروتينون بشكل فعال.
- يكشف التتبع النظائري عن تكيفات أيضية ملحوظة.
- يوفر الفصل الكروماتوغرافي السائل-مطياف الكتلة تقديرًا كميًا دقيقًا.
- تعتبر هذه الطريقة قابلة للتطبيق في تصاميم تجريبية متنوعة.
الاستنتاجات
- تعد الصفائح الدموية البشرية المعزولة نموذجاً قيماً لدراسة عملية التمثيل الغذائي.
- يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى فهم آليات المرض والعلاجات المحتملة.
- يمكن للدراسات المستقبلية التوسع في هذه الطريقة لاستكشاف مسارات أيضية أخرى.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
توفر الصفائح الدموية البشرية نموذجاً ذا صلة سريرياً وغير متحول لدراسة التمثيل الغذائي للميتوكوندريا وتأثيرات المواد الغريبة، مما يعالج أوجه القصور في الخطوط الخلوية السرطانية في أبحاث التمثيل الغذائي. تتيح هذه المنصة تحليلاً قابلاً للتكرار ومحدداً لكل متبرع في التغيرات التي تطرأ على مسارات التمثيل الغذائي، مما يدعم التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. كما تسهل إمكانية التوسع من خلال التوريد من بنوك الدم الاستمرارية الانتقالية من الاكتشاف الأساسي إلى الدراسات قبل السريرية والسريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكن من استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال فحص الاستجابات الميتوكوندرية لمثبطات المعقد I مثل rotenone.
- القيمة التشغيلية: توفر نظاماً ذا صلة بالبشر يقلل من المتغيرات المربكة الناتجة عن إعادة البرمجة الأيضية في الخطوط الخلوية المحولة.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال الكشف المتسق عن التحولات الأيضية التعويضية، مثل زيادة أكسدة الأحماض الدهنية عند تثبيط تحلل السكر.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج قراءات كمية بواسطة تقنية LC-MS لثيواسترات acyl-CoA، مما يتيح التحديد الكمي النسبي والوسم النظائري لتقييم النشاط الخاص بالمسارات الحيوية.
- القيمة التشغيلية: يوفر ملفات تعريف أيضية قابلة للتكرار عبر المكررات البيولوجية، مما يدعم توحيد المقايسة لحملات فحص المواد الغريبة (xenobiotics).
- القابلية للتوسع: يتيح عزل الصفائح الدموية من متبرعين أفراد أو من بنوك الدم إنتاجاً قابلاً للتوسع لعينات نشطة أيضياً من أجل الفحص عالي المحتوى.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: تربط الاستجابات الصفائحية خارج الجسم (ex vivo) بالتكيفات الأيضية داخل الجسم (in vivo)، مما يدعم التحقق المسبق سريرياً المتوافق مع المؤشرات الحيوية.
- تقليل المخاطر الآلية: توضح ما إذا كانت التغيرات الأيضية الملحوظة تعتمد على الميتوكوندريا، كما يتضح من الاستجابات في الصفائح الدموية عديمة النواة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تتيح تقييم فعالية التدخل في عكس العيوب الأيضية، مما يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف في مرحلة تحسين المركبات الرائدة.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم التقييم قبل السريري، لا سيما بالنسبة للمركبات التي تستهدف الميتوكوندريا والمعدلات الأيضية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات حول تأثيرات المواد الغريبة الحيوية على التمثيل الغذائي الخلوي من خلال عزل استجابات الصفائح الدموية للمعالجة بالروتينون المعتمدة على الجرعة.
- الفحص: يتيح تحضير الصفائح الدموية لتكون جاهزة للمقايسة من أجل تحليل LC-MS، مما يعطي مخرجات كمية قابلة للتكرار لفحص مكتبات المركبات.
- التحليلات: يوفر تكميماً نسبياً لثيواسترات acetyl-CoA وsuccinyl-CoA وbeta-hydroxybutyryl-CoA، مما يسمح بمقارنة التدفقات الأيضية عبر الظروف المختلفة.
- الأبحاث traslational: يتوافق مع الاستمرارية قبل السريرية من خلال نمذجة التكيفات الأيضية ذات الصلة بالحالات المرضية والتدخلات العلاجية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لسير عمل قياسي لعزل الصفائح الدموية واستخلاص النواتج الأيضية يمكن تطبيقه عبر مشاريع ومجالات علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال استخدام نموذج بشري ذي صلة فسيولوجياً يتجنب العيوب الاصطناعية المرتبطة بخطوط الخلايا السرطانية.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار من خلال توحيد بروتوكولات عزل الصفائح الدموية، والتحدي خارج الجسم (ex vivo)، واستخلاص المستقلبات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين الكشف المبكر عن نقاط الضعف الأيضية، مما يقلل من معدلات الفشل في المراحل المتأخرة الناتجة عن السمية الميتوكوندرية غير المتوقعة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات للمركبات بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً لتأثيراتها على المسارات الأيضية الأساسية في نظام بشري ذي صلة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في عزل الصفائح الدموية، والتعامل المعقم مع الخلايا، والتحليل الأيضي باستخدام تقنية LC-MS/MS.
- يعتمد على توفر أجهزة الطرد المركزي، ومجمعات التفريغ للاستخلاص بالطور الصلب، وأنظمة HPLC-MS.
- يستلزم توحيد معايير تحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية وجرعات الروتينون (rotenone) عبر المختبرات والمتبرعين المختلفين.
- يتضمن اعتبارات التكييف لمختلف المواد الغريبة عن الجسم (xenobiotics) ومخططات الوسم النظائري.
- يتقيد بمدى حيوية الصفائح الدموية خارج الجسم (ex vivo) والحاجة إلى المعالجة الفورية بعد العزل للحفاظ على السلامة الأيضية.
