الأجسام المضادة ملزم خصوصية لكابا (Vκ) ضوء الإنسان (الغلوبولين المناعي) الأجسام المضادة التي تحتوي على سلسلة: Polysialic حمض (PSA) المرفقة لNCAM كدراسة حالة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المستضدات للأجسام المضادة ذات الإمكانات العلاجية مع التركيز على النمط المتماثل IgM. تملأ هذه الطريقة فجوة معرفية في المجال الطبي الحيوي وقد تساعد في تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة وعوامل العلاج المناعي لأبحاث السرطان وأمراض الجهاز العصبي المركزي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تفتح الباب أمام فئة مهملة من الأجسام المضادة ذات الإمكانات العلاجية الكبيرة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج جميع الأمراض التي يمكن استهدافها بواسطة العلاجات القائمة على الأجسام المضادة. ما يمكن أن يوفر هذا الأمر نظرة ثاقبة على مستضدات الأجسام المضادة IgM ونمو الأنسجة والثقافات الفرعية. يمكن أن يكون أيضا آفة للأنماط التماثلية الأخرى للأجسام المضادة من جميع الأنواع.

خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركت ارتباطا محددا وبروزا للجسم المضاد IgM في تطبيقات كيميائية حيوية مختلفة. سيظهر الإجراء روبرت كاهود وينس واتزلاويك. لبدء هذا الإجراء ، قم بعمل قطع في الجمجمة باتجاه الأمام على مستوى الأذن وقشر الجمجمة للخلف.

ثم ضع الدماغ برفق في أنبوب سعة 15 ملليلترا ، وقم بتخزينه على الفور على الثلج الجاف. بعد خمس دقائق ، انقل الدماغ إلى ورق وزن نظيف وقم بإزالة المخيخ وجذع الدماغ بسرعة باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. بعد ذلك ، قم بوزن المخ المجمد قبل نقله مرة أخرى إلى أنبوب سعة 15 مليلتر على الجليد.

أضف المخزن المؤقت للتحلل المثلج إلى التركيز النهائي البالغ 150 ميكروغراما من أنسجة المخ لكل ميكرولتر من محلول التحلل. بعد ذلك ، قم بتجانس الدماغ في مخزن التحلل عن طريق التخلي من خلال طرف ماصة سعة مليلتر واحد متبوعا بالخلية من خلال حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 27. بعد ذلك ، احتضان تحلل الدماغ لمدة 30 دقيقة إضافية على الجليد للسماح بتحلل الأنسجة بالكامل.

بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة المنظفات والمواد غير القابلة للذوبان ودهون الدماغ إلى الطرد المركزي التسلسلي. تخلص من المايلين وحطام الخلية المحتوي على الحبيبات ، ولكن احتفظ بالمادة الطافية بعد كل خطوة من خطوات الطرد المركزي. Aliquot للدماغ تحلل, وتخزينها في 80 درجة مئوية.

في هذه الخطوة ، قم بإعداد 200 مل من IP Buffer مع BSA و 200 مل أخرى من IP Buffer بدون BSA. لتفاعل الترسيب المناعي ، انقل 100 ميكرولتر من ملاط بروتين L agarose إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت IP مع BSA إلى الأنبوب.

ثم امزجها يدويا عن طريق الانعكاس. بعد ذلك ، اغسل حبات البروتين L agarose أربع مرات عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الاغاروز وكرر إجراء الغسيل ثلاث مرات أخرى.

بعد ذلك ، أضف BSA الطازج الذي يحتوي على مخزن IP إلى بروتين L agarose واحتضانه طوال الليل على أسطوانة عند أربع درجات مئوية. في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP الذي يحتوي على BSA و 30 ملليغرام من أنسجة المخ المحللة ، أضف 20 ميكروغراما من الجسم المضاد التجريبي أو الجسم المضاد للتحكم أو PBS. احتضان 30 ملليغرام من أنسجة المخ المحللة في المخزن المؤقت IP المثلج البارد مع الجسم المضاد IgM في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملم طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بتدوير حبات Protein L agarose في جهاز طرد مركزي على الطاولة. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الاغاروز. ثم أضف محلول تحلل الدماغ للأجسام المضادة المبرد إلى بروتين L agarose.

احتضان مستضد الجسم المضاد ، معلق بروتين L agarose لمدة ساعتين على أسطوانة عند أربع درجات مئوية. بعد ساعتين ، اغسل مركب مستضد الأجسام المضادة المتصل ب agarose L من خلال الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت IP البارد المثلج الذي يحتوي على 0.2٪ BSA إليه.

كرر خطوة الغسيل مرة أخرى باستخدام مخزن IP البارد المثلج الذي يحتوي على 0.2٪ BSA ومرتين إضافيتين باستخدام المخزن المؤقت IP البارد بدون BSA. بعد ذلك ، قم بتدوير مركب مستضد الجسم المضاد المتصل ب agarose L.استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر للتخلص من المادة الطافية حتى يترك حوالي 50 ميكرولترا من المحلول في الأعلى أعلى حبيبات بروتين L agarose. بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة 10 ميكرولتر لإزالتها تماما.

احتفظ بجميع العينات على الجليد. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت لشطف IP إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بتحريك الأنبوب بالإصبع ست مرات وقم بتسخينه لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية.

بعد ذلك ، ضع العينة على الجليد لمدة دقيقتين وقم بتدويرها لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، انقل 35 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مقاس 1.5 ملم دون إزعاج الحبيبات. بعد ذلك ، تأكد من عدم وجود حبات بروتين L agarose عن طريق شطف كمية صغيرة من العينة المخففة في جدار الأنبوب الداخلي.

في حالة وجود حبات بروتين L الاغاروز ، قم بتدوير العينة لمدة 30 ثانية أخرى عند 13 ، 000 مرة جم وانقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف. كرر هذه الخطوة حتى لا يمكن اكتشاف حبات الاغاروز. بعد ذلك ، قم بتحميل 10-20 ميكرولترا من العينات المخففة لكل بئر على جل بولي أكريلاميد SDS ونظام عازلة tris-glycine SDS وقم بتشغيل الجل لمدة ساعة تقريبا عند 100 فولت على سطح الطاولة دون تبريد إضافي.

، انقل البروتينات إلى غشاء PVDF. يتم نقل البروتينات لمدة ساعتين ونصف في الغرفة الباردة عند 100 فولت باستخدام مخزن مؤقت للنقل البارد. قم بسد الغشاء بوزن 10٪ لكل حجم من مسحوق الحليب الجاف في PBS-T لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية على شاكر مداري على الطاولة.

اغسله مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام PBS-T. فحص الغشاء بالجسم المضاد الأولي في 5٪ BSA في PBS-T. احتضن على شاكر مداري في الغرفة الباردة طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، اغسل الغشاء مرة واحدة بزيادة PBS-T عند 25 درجة مئوية متبوعا بثلاث غسلات باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق لكل منها على شاكر مداري. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد الثانوي و 5٪ من مسحوق الحليب الجاف في PBS-T إلى الغشاء واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية على شاكر مداري. بعد ذلك ، اغسل الغشاء مرة واحدة مع PBS-T الزائد عند 25 درجة مئوية متبوعا بثلاث غسلات باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق لكل منها على شاكر مداري.

امزج ملليلترا واحدا من مكون الركيزة HRP المبرد المسبب للتلألؤ الكيميائي A مع مليلتر واحد من المكون B عند 25 درجة مئوية. انقل الغشاء على منشفة ورقية لإزالة السوائل الزائدة. ثم جفف الحاوية بالمناشف الورقية قبل إعادة الغشاء إليها.

على الفور ، أضف ملليلترين من ركيزة HRP المعززة للتلألؤ الكيميائي الممزوجة مسبقا إلى الغشاء واحتضنها لمدة دقيقتين عند 25 درجة مئوية. قم بإمالة الحاوية يدويا كل 20 ثانية لترطيب الغشاء بشكل موحد. بعد ذلك ، انقل الغشاء إلى غلاف بلاستيكي شفاف وقم بإزالة فقاعات السوائل والهواء الزائدة باستخدام مناشف ورقية.

قم بلصق الغلاف البلاستيكي في الكاسيت وأغلقه. يوضح هذا الشكل أن HigM12 المناعي يترسب مستضده من تحلل الدماغ الدماغي ويعمل كعامل كشف في البقع الغربية. لا الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل ولا حبات الاغاروز L تترسب مناعية مستضد مماثل يوضح خصوصية السحب لأسفل.

هنا ، توضح البقع الغربية التي تستخدم محللات الجهاز العصبي المركزي من النوع البري والفئران بالضربة القاضية NCAM خصوصية ارتباط HIgM ب PSA الذي يحتوي على NCAM'Enzymatic الهضم الأنزيمي لأنسجة الجهاز العصبي المركزي من الفئران البرية باستخدام ENDO-NF يحدد PSA المرتبط ب NCAM باعتباره apitope الملزم المحدد ل HIgM12. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، يتم الحصول على ثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الإيجابية IBA-1 ذات النقاء العالي. على عكس الخلايا الدبقية الصغيرة ، تم إثراء مستضدات سطح الخلية المستهدفة HIgM12 و A2B5 بشكل كبير في مزارع OPC للفئران في ظل ظروف الخلايا الحية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 13 ساعة عمل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل Biacore أو تقنية رنين البلازمون السطحي لتحديد الأجسام المضادة التي ترتبط بثوابت الارتباط والارتباط. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السرطان والعلاجات المناعية والأجسام المضادة الذاتية الطبيعية لتحديد الكربوهيدرات على البروتينات المتشابهة كمستضدات للأجسام المضادة IgM العلاجية في البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على مستضدات البروتين السكري للعمل البحثي الذي يحتوي على أجسام مضادة IgM البشرية. توفر البيانات هدفا جديدا لعلاج مرض التصلب المتعدد. PSA ENCAP ، علاج الأجسام المضادة الذي طورناه هو واحد من أوائل العلاجات التي أظهرت تحسنا وظيفيا في صندوق النشاط باستخدام النموذج الصارم الموجود في المرض وتقليل قيمة المرض المشابه للتصلب المتعدد.